自然發酵酸菜汁中乳酸桿菌的分離與鑒定

孟建宇，徐慧欣

(內蒙古農業大學 生命科學學院應用與環境微生物實驗室, 呼和浩特 010011)

酸菜是大眾化蔬菜腌漬品，在我國歷史悠久，是東北、內蒙古等地區的主要副食品之一，深受消費者的喜愛。研究酸菜發酵微生物對于酸菜品質的提升具有一定的現實意義[1]。乳酸菌是指一類能將可發酵性碳水化合物降解，產生大量乳酸的非病原性的革蘭氏陽性球菌或桿菌的總稱,主要有乳酸球菌屬、乳酸鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和芽孢桿菌屬[2,3]。乳酸菌能使發酵酸菜產酸、產細菌素，提高食品營養價值，改善食品風味，延長保存時間，對人體具有多方面的保健作用[4,5]，如能調節腸道菌群，維持體內微生態平衡，消除體內有毒物質的產生，降低膽固醇，增強免疫力等[6]。對傳統發酵蔬菜中乳酸菌多樣性的研究，對于開發和利用我國傳統發酵食品中蘊含的微生物資源，闡明發酵蔬菜品質的形成機理，進而改進發酵蔬菜的生產工藝有著重要的現實意義[7]。乳酸菌對食品工業有重要的經濟價值，并且乳酸菌及其細菌素可作為天然來源的食品添加劑[8，9]，因此，對傳統食品中乳酸菌資源進行開發，篩選出生長性能好、產酸力強、抗性強的優良菌株，才能更好地滿足食品工業發酵過程。本試驗利用經典分類法和16S rDNA序列分析法，對自然發酵酸菜汁中的乳酸菌進行分離、鑒定，為其進一步深入研究和開發利用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

農家酸菜汁:采自內蒙古農業大學家屬院自制酸菜。

1.1.2 培養基

乳酸菌分離培養基：牛肉膏1%；蛋白胨1%；酵母膏1%；葡萄糖1%；番茄汁10%； 吐溫80 0.05%；CaCO32%；溴甲酚綠0.01%；瓊脂1.5%； 蒸餾水100 mL；胡蘿卜汁10%；pH 6.5。

1.1.3 主要儀器設備

JA2003型電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；SX-500 型全自動高溫高壓滅菌鍋 TDMY KOGYO 公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；移液器 Bay Gene Biotech公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫療儀器廠；GSP-9080 MBE型隔水式恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HR40-ⅡA2型生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；T6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Z-16PK離心機 Sigma公司；2720 PCR儀 美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化

采用10倍稀釋法將樣品懸浮液稀釋至10-7, 取每個濃度的稀釋液100 μL均勻涂布于固體培養基平板，30 ℃恒溫培養3～5 d，每個稀釋度做3個重復。觀察平板中菌落生長情況，挑選特征菌落進行分離純化，并對其進行形態特征觀察和生理生化實驗[10]。

1.2.2 菌株的16S rDNA序列分析

DNA的提取參考文獻[11]的方法。選用細菌通用引物對27F(5′-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3′)和1492R(5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)進行PCR擴增。PCR產物采用SYBR Green Ⅰ作為標記，在1%(W/V)瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中進行電泳測定。以Marker DL2000作為對照，在紫外燈下觀察DNA譜帶，照相。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京中科瑞泰有限公司)進行純化。用質粒連接試劑盒(pMD19-T vector，大連寶生物工程有限公司)進行目的片段的連接。用M13(M13+5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′、M13-5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)引物進行菌落PCR擴增重組質粒檢測，將陽性克隆擴培后由中可瑞泰公司測序。獲得的核酸序列用GenBank數據庫中的序列進行Blast相似性比較，并下載最相似序列。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的形態和生理生化試驗

從農家自然發酵的酸菜汁中分離到3株乳酸菌菌株，菌落形態見表1，部分生理生化試驗見表2。3株乳酸菌均為G+菌，菌落邊緣整齊，表面濕潤，不透明，產色素。生理生化試驗顯示：過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗均為陰性，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長。菌落形態和生理生化試驗顯示符合乳桿菌屬特征。

表1 乳酸菌菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria

表2 乳酸菌的生理生化試驗Table 2 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

2.2 菌株的16S rDNA鑒定

提取菌株的DNA后用瓊脂糖凝膠進行檢測，DNA電泳結果(見圖1)顯示得到的DNA較完整，可用于后續的分析。對菌株的DNA進行16S rDNA PCR擴增，產物條帶位于Marker的2000～1000 bp之間，約1400 bp(見圖2)，符合預期長度。產物純化后進行pMD19-T載體連接轉化，挑取陽性克隆子進行菌落PCR檢測后測序。測序得到3株乳酸菌16S rDNA部分片段，長度均約為800 bp，利用NCBI數據庫的Blast程序進行同源性分析，結果見表3。SC2-1、SC2-3、SC4-1與Lactobacillusplantarum的相似度均為100%。

圖1 純菌DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis for the detection of pure bacteria DNA

圖2 PCR產物電泳圖Fig.2 PCR product electrophoretogram

菌株編號Blast最高同源菌 相似度(%) 最高同源屬名SC2-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC2-3Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬SC4-1Lactobacillus plantarum100乳桿菌屬

3 結論與討論

從自然發酵酸菜汁中分離到3株乳酸菌SC2-1、SC2-3和SC4-1，菌落為圓形，濕潤，表面光滑或凸起，不透明，深綠色；過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗等均為陰性，G+，可以利用葡萄糖和半乳糖，在15 ℃、pH 4.5條件下生長；對其進行16S rDNA序列測定，利用NCBI數據庫的Blast程序對測序獲得的序列進行同源性分析， 3株菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的相似度達100%。形態特征和生理生化試驗及16S rDNA序列分析顯示，該3株乳酸菌均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。

酸菜是經過乳酸菌發酵形成的。乳酸菌及其代謝產物中既不具備分解纖維素的酶系統，也不具備水解蛋白質的酶系。因此，既不會破壞植物細胞組織，又不會分解蛋白質和氨基酸；既能保鮮，又可增強產品風味[12]。酸菜中乳酸菌各項性能的優劣直接關系到泡菜的質量，所以乳酸菌對于提高酸菜的營養價值極為重要。研究自然發酵酸菜微生物變化趨勢，分離自然發酵酸白菜中的優良菌株，再利用混合發酵技術模擬自然條件接種發酵，可在提高產品風味和品質的前提下縮短發酵周期[13]。

植物乳桿菌常存在于發酵的蔬菜和果汁中，是傳統醬腌菜中的優勢菌[14]。植物乳桿菌還是人體腸道常見的乳桿菌之一，對調節宿主健康具有重要的作用，是目前研究的熱點[15]。相關報道表明，我國一些少數民族地區的傳統發酵食品如酸馬奶、開菲爾等的乳酸菌資源開發利用較多。內蒙古地區百姓家有制作醬腌菜的傳統，其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源還未被開發利用。因此，針對從內蒙古地區百姓家庭自然發酵的醬腌菜中采集、分離獲取的植物乳桿菌進行深入研究，對篩選性狀優良的植物乳桿菌菌株，以及對植物乳桿菌的進一步開發利用具有重要的意義。