紅曲霉液態發酵產色素及穩定性的研究

鄧加聰，杜可，韓艷麗，鄭虹,2

(1.福建師范大學福清分校 海洋與生化工程學院，福建 福清 350300； 2.食品軟塑包裝技術福建省高校工程研究中心，福建 福清 350300)

隨著人們健康意識的增強，天然色素越來越受廣大消費者的青睞，特別是由紅曲霉合成的紅曲色素，具有調節血壓、抗突變、抑菌等活性，是一類安全、無毒的天然食用色素[1-3]。紅曲色素在肉制品、面包制品、豆腐乳制品、釀酒行業等食品制作中都得到了廣泛的應用[4-6]。

目前，紅曲色素的發酵生產方法主要有固態發酵和液態發酵[7-9]，其中由于液態發酵具有發酵周期短、不易染菌等優點，近年來深受人們的關注。付榮霞等[10]從不同碳源、氮源、pH、裝液量等方面對紅曲霉產紅曲色素的液態發酵條件進行了研究，結果表明：其最佳的發酵工藝條件是以3%玉米粉為碳源，0.02%酵母膏為氮源，pH為4.0，裝液量為125 mL/250 mL，此時紅曲色素的總色價可達93.66 U/mL。王艷等[11]得到紅曲霉產紅曲色素的最佳工藝條件為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此優化條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，比優化前(33.62 U/mL)提高了3.13倍。

為了更好地開發利用紅曲色素，本文不僅從裝液量、時間、接種量、金屬離子及維生素添加量等方面對紅曲霉發酵產紅曲色素的工藝條件進行了研究，還從pH、光照、添加劑等方面研究了紅曲色素的穩定性，為紅曲色素的生產及在食品行業中的進一步開發應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲霉(Monascusrubber)：保存于福建師范大學福清分校生物工程實驗室；蔗糖、蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鋅等試劑：均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；試管斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)；種子培養基(g/L)：蔗糖30、蛋白胨30、KH2PO40.5、MgSO40.5、pH 5.5～6.0；發酵培養基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨30、KH2PO42.0、MgSO41.0、硝酸鈉 0.1、pH 6.0。

SPX-150B-Z生化培養箱 福州精科儀器儀表有限公司；722SP分光光度計 上海棱光技術有限公司；TG16-WS高速臺式離心機 上海湘儀有限公司；BS224S電子天平 賽多利斯儀器系統有限公司；FA2204B電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；T.HZ-C臺式恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；NRY-2102C恒溫培養震蕩器 南榮實驗室設備有限公司；DKS-24數顯恒溫水浴鍋 上海精密實驗設備有限公司；CDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺 福州伍聯醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉的活化及種子液的制備

挑取4 ℃冰箱保存的紅曲霉劃線接種于試管斜面，30 ℃活化培養5 d；挑取活化后的紅曲霉接至裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min振蕩培養3 d。

1.2.2 紅曲霉液態發酵優化的單因素試驗

將培養好的種子液按不同接種量接至不同裝液量，添加不同金屬離子濃度及不同維生素濃度的發酵培養基中(添加有數粒玻璃珠)，30 ℃、180 r/min振蕩培養一定時間后，發酵液在8000 r/min離心5 min，分別收集上清液和菌絲沉淀，測定上清液的紅曲色素。裝液量梯度為25，50，75，100，125，150 mL/250 mL三角瓶；接種量梯度為1%、3%、5%、7%、9%、11%；培養時間梯度為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 d；金屬離子(硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鐵)添加量梯度為0，0.025，0.05，0.075，0.100，0.125，0.150 mmol/L；維生素(維生素B1、維生素B3、維生素B5、葉酸、維生素H)添加量梯度為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。

1.2.3 紅曲霉液態發酵優化的正交設計試驗

根據單因素試驗結果，采用五因素三水平對紅曲霉液態發酵進行正交試驗設計，其因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 發酵液中紅曲色素色價的測定

紅曲紅色素色價的測定采用GB 15961-2005《食品添加劑 紅曲紅》。

1.2.5 紅曲色素的穩定性研究[12-15]

1.2.5.1 溫度對紅曲色素穩定性的影響

取10 mL發酵上清液于25 mL具塞試管中，分別置于20，40，60，80，100 ℃水浴中，每隔0.5 h測定色價。

1.2.5.2 光照對紅曲色素穩定性的影響

取10 mL發酵上清液于25 mL具塞試管中，分別在18 W日光、自然光、避光下放置，每隔12 h取樣測定色價。

1.2.5.3 pH對紅曲色素穩定性的影響

取10 mL發酵上清液于25 mL具塞試管中，用0.1 mol/L鹽酸或0.1 mol/L氫氧化鈉將pH調至1，3，5，7，9，11，室溫下放置一定時間，每隔2 h取樣測定色價。

1.2.5.4 氧化劑、還原劑及添加劑對紅曲色素穩定性的影響

取10 mL發酵上清液于25 mL具塞試管中，分別添加維生素C、雙氧水、苯甲酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)及亞硝酸鈉等，使其終濃度為100 mg/L。搖勻后，避光保存，每隔2 h取樣測定色價。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉產紅曲色素產量的單因素試驗

2.1.1 裝液量對紅曲霉液態發酵的影響

圖1 裝液量對紅曲霉的發酵產色素的影響Fig.1 The effect of loading volume on pigment produced by Monascus

由圖1可知，隨著裝液量的不斷升高，紅曲霉所產紅曲色素的色價含量呈先增后降的趨勢；當裝液量為75 mL時，紅曲色素的產量達到最高，其色價值可達到279.60 U/mL。紅曲霉為好氧菌，裝液量主要影響液體發酵培養基中的溶氧量，當其他培養條件相同時，隨著裝液量的增加，發酵液中單位體積的溶氧量下降，紅曲色素產量在一定程度上會有所下降。付榮霞等研究發現，裝液量125 mL/250 mL時，紅曲霉產生的紅曲色素最高，總色價可達93.66 U/mL。

2.1.2 接種量對紅曲霉液態發酵的影響

圖2 接種量對紅曲霉發酵產色素的影響Fig.2 The effect of inoculation amount on pigment produced by Monascus

由圖2可知，隨著接種量的不斷升高，紅曲霉所合成的色價含量先增大后減小，之后接種量繼續增大色價再變小；當接種量為7%時，紅曲霉所合成的色價含量達到最高，其色價值可達到373.55 U/mL。接種量過少，菌體生長緩慢，發酵時間長，色素產量低；接種量過多，會導致發酵前期營養物質消耗過快，使發酵液體黏度增加，影響菌絲體生長劑色素的合成和分泌。因此，紅曲霉發酵產紅曲色素的最適接種量為7%。這與李慧等[16]的實驗結果有所不同，李慧等的研究結果表明5%的接種量對紅曲霉液態發酵效果較好。

2.1.3 培養時間對紅曲霉液態發酵的影響

圖3 培養時間對紅曲霉發酵產色素的影響Fig.3 The effect of culture time on pigment produced by Monascus

由圖3可知，隨著培養天數的遞增，紅曲霉所合成的紅曲色素含量逐漸增高，當培養時間為7 d時，紅曲色素的含量達到最大，其色價可達429.39 U/mL；之后，隨著培養時間的延長，色素含量反而逐漸減少。估計是因為紅曲霉發酵培養到一定時間后，體系中的營養物質逐漸耗盡，導致紅曲霉生長緩慢，而紅曲色素的產量也隨之減少。因此選擇培養時間7 d為最佳培養時間。而邱鵬等[17]得到的最適培養時間為10 d，紅曲霉發酵培養10 d后，其紅曲色價可達112 U/L。

2.1.4 金屬離子對紅曲色素產量的影響

圖4 金屬離子對紅曲霉發酵產色素的影響Fig.4 The effect of mental ions on pigment produced by Monascus

由圖4可知，與未添加銅離子的對照相比，加入銅離子后，色價隨銅離子濃度的增加而逐漸降低，表明發酵液中的紅曲色素產量減少，最后趨于平緩；加入亞鐵離子后，色價隨亞鐵離子濃度的增加逐漸增加，當亞鐵離子濃度達到0.01 mmol/L時，色價達到最大值，為503.00 U/mL；之后，色價隨著亞鐵離子的增加而逐漸減少；當亞鐵離子>0.02 mmol/L，色價變化不是很大；與對照相比，發酵液的色價隨鐵離子濃度增加呈先增后降的趨勢，當鐵離子濃度為0.01 mmol/L時，色價達到最大值，為512.33 U/mL。

2.1.5 維生素對紅曲色素產量的影響

圖5 維生素對紅曲霉發酵產色素的影響Fig.5 The effect of vitamins on pigment produced by Monascus

由圖5可知，與對照CK(紅曲色素產量為476.40 U/mL)相比，不同維生素對紅曲霉產紅曲色素的影響各不相同，維生素B1和維生素B3對紅曲色素產量有促進作用，維生素B5和葉酸對紅曲色素產量影響不大，而維生素H對紅曲色素的合成具有抑制作用。不同濃度的同一種維生素對紅曲色素產量的影響，都是先增后降；其中當維生素B1和維生素B3的濃度為0.03%時，紅曲色素的產量均達到最大，分別為647.02 U/mL和635.26 U/mL。這與楊成龍等[18]得到的結果相一致。

2.2 紅曲霉液態發酵優化的正交設計試驗

為了探討紅曲霉液態發酵的最適條件，采用七因素三水平對裝液量、接種量、培養時間、硫酸亞鐵添加量及維生素B1添加量5個因素進行正交試驗。正交試驗結果分析見表2。

表2 L18(37)正交試驗結果的直觀分析Table 2 Visual analysis of results of L18(37)orthogonal test

由表2極差分析可知，D>E>B>C>A，即影響紅曲霉液態發酵產色素的因素順序為：硫酸亞鐵添加量>維生素B1添加量>培養時間>接種量>裝液量。根據各試驗因子的平均值，得到最佳組合為A3B2C3D1E3，即：裝液量為100 mL/250 mL，培養時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1添加濃度為0.05%。

2.3 驗證試驗

由正交表得到的最佳組合(A3B2C3D1E3)與試驗結果得到紅曲色素產量最高的組合(A2B2C3D1E2)不一致，因此對兩個組合進行驗證試驗，驗證試驗結果見表3。

表3 驗證試驗結果Table 3 Results of verification test

由表3驗證試驗結果可知，組合A2B2C3D1E2與組合A3B2C3D1E3相比，前者對紅曲霉液態發酵的效果更佳。即當培養裝量為75 mL/250 mL，培養時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1的添加濃度為0.03%。在此條件下，紅曲霉的色價可達714.80 U/mL。

2.4 紅曲色素穩定性研究

2.4.1 pH對紅曲色素穩定性的影響

圖6 pH對紅曲色素穩定性的影響Fig.6 The effect of pH on the stability of Monascus pigment

由圖6可知，在同一時間下，紅曲色素的色價隨著溶液中pH值的升高而呈先增后降的趨勢，當pH為7時，紅曲色價均達到最大值；在同一pH溶液中，紅曲色素的色價基本上隨著時間的延長呈先增后降的趨勢，但是變化趨勢不是很明顯。因此，紅曲色素最適保存的pH為7。

2.4.2 光照對紅曲色素穩定性的影響

由圖7可知，不同光照對紅曲色素色價的影響各不相同，在同一時間下，光照對紅曲色素色價的影響如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；對于同一種光照方式，紅曲色素的色價均隨著光照時間的延長而逐漸降低。因此，紅曲色素避光保存的效果最佳。

圖7 光照對紅曲色素穩定性的影響Fig.7 The effect of illumination on the stability of Monascus pigment

2.4.3 食品添加劑對紅曲色素穩定性的影響

圖8 食品添加劑對紅曲色素穩定性的影響Fig.8 The effect of food additives on the stability of Monascus pigment

由圖8可知，食品添加劑苯甲酸鈉和亞硝酸鈉對紅曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA會使紅曲色素的色價降低，維生素C和雙氧水對紅曲色素的影響不大。

3 結論

試驗對紅曲霉的液體搖瓶發酵工藝進行了初步研究：考察了裝液量、時間、接種量、金屬離子及維生素等因素對紅曲霉液體發酵產紅曲色價的影響。結果表明：當培養裝液量為75 mL/250 mL，培養時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1添加濃度為0.03%時最有利于紅曲霉合成紅曲色素，其色價可達714.80 U/mL。

從光照、pH和食品添加劑對紅曲霉所產紅曲色素的穩定性方面進行初步研究，研究結果發現，在同一時間下，紅曲色素的色價隨著溶液中pH值的升高而呈先增后降的趨勢，當pH為7時，紅曲色價均達到最大值；在同一pH溶液中，紅曲色素的色價基本上隨著時間的延長呈先增后降的趨勢，但是變化趨勢不是很明顯。在同一時間下，光照對紅曲色素色價的影響如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；對于同一種光照方式，紅曲色素的色價均隨著光照時間的延長而逐漸降低。食品添加劑苯甲酸鈉和亞硝酸鈉對紅曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA會使紅曲色素的色價降低，維生素C和雙氧水對紅曲色素的影響不大。這與全桂靜等[19]的研究結果相一致。