高效液相色譜法測定自制紅曲米中麥角固醇的含量

李雨恒，孫曉東，劉潤璞，楊靈絲

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116600)

紅曲又稱“丹曲”、“赤曲”，在我國已有一千多年的食用歷史，被廣泛應用于釀酒、發酵、調味劑、著色劑和藥物等方面[1-3]。1979年日本遠藤氏從紅曲中發現了可以抑制膽固醇合成的Monacolin K[4]，紅曲及其發酵產物漸漸走入人們的視線。此后研究發現紅曲具有抗菌抑菌、降血壓、防癌和防止佝僂病等多種功效[5，6]，更加被人們所關注。麥角固醇又名麥角甾醇，最早發現于小麥的寄生菌——麥角菌中，其含量與真菌生物量存在正相關，在紅曲米的固態發酵產物中可通過麥角固醇的含量來衡量發酵菌株的生物量[7，8]。麥角固醇經紫外線照射可轉變為維生素D，促使老人與孕婦對鈣和磷的吸收，同時它用于可的松、激素黃體酮的生產，是重要的醫藥化工原料[9，10]。紅曲米固態發酵產生麥角固醇的適宜溫度為26～30 ℃，此時可得到較高的產量，而溫度的升高不利于真菌產麥角固醇[11]，因此本研究3種菌發酵自制紅曲米的溫度為28 ℃。本研究為篩選麥角固醇生產菌，提高紅曲米的藥用價值奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中的3株菌均為紫紅曲霉(Monascuspurpureus)，其中SD3分離自山東柿餅，Fen和A13分離自丹東家庭自制豆醬。3株菌均于實驗室4 ℃保存。

1.2 試劑

提取用無水乙醇、乙醚、氫氧化鈉：均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；麥角固醇標準品(純度≥98%)：上海源葉生物技術有限公司；液相用乙醇、甲醇：色譜純，德國默克公司；泰國香米：購于超市；水：超純水。

1.3 儀器設備

Agilent 1260 型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；CP225D 型電子天平 德國 Sartorius公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀 美國Millipore公司；101-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱 上海坤天實驗室儀器有限公司；HH-3D恒溫水浴鍋 上海儀純實業有限公司；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺 上海滬凈凈化設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將3株菌接種于PDA平板上，于30 ℃培養7 d。

1.4.2 液體發酵培養

制作種子培養基：葡萄糖60 g，蛋白胨25 g， NaNO32 g， MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4·3H2O 1 g，pH為5.5，121 ℃滅菌20 min。

將3株菌接入種子培養基中，28 ℃,180 r/min培養7 d。

1.4.3 紅曲米的制備

將從超市購入的泰國香米浸泡過夜，瀝干水分，放入500 mL罐頭瓶中，每瓶100 g， 121 ℃滅菌60 min。超凈臺中加入20 mL液體發酵后的菌液，每種菌3個重復， 28 ℃黑暗培養15 d。

1.4.4 紅曲米的烘干

將自制紅曲米均勻平鋪于濾紙上，置于60 ℃烘干箱中4 h。將烘干后的紅曲米收集，碾碎保存。

1.4.5 麥角固醇樣品的制備

稱取50 g NaOH于80 mL超純水中，用無水乙醇定容到200 mL，配制成堿乙醇溶液。精確稱取0.5 g烘干后的紅曲米于比色管中，取16 mL堿乙醇加入到比色管中，放入85 ℃的恒溫水浴鍋中，皂化1.5 h后向其中補加乙醇至20 mL，繼續皂化1 h，取出，冷卻至室溫。加入10 mL乙醚并震蕩30 s，靜置40 min，用超純水水洗至中性，放入40 ℃的水浴鍋中將乙醚全部蒸干。向比色管中加入甲醇，使麥角固醇完全溶解，經0.45 μm的膜微濾，得到標準樣品溶液。

1.4.6 高效液相法檢測麥角固醇

1.4.6.1 麥角固醇標準溶液的制備

精確稱取100 mg(精確到0.0001 g)標準品用乙醇溶解，并定容至100 mL，制成1 mg/mL的標準儲備液，用儲備液配制10，100，500，1000 μg/mL的標準液，置于4 ℃保存。

1.4.6.2 色譜條件

高效液相色譜儀：Agilent 1260；色譜柱ZORBAXEclipse SB-C18(5，250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：甲醇；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外可見光檢測器；檢測波長：284.0 nm；進樣量：20.000 μL。

1.4.6.3 麥角固醇含量的計算

式中：C為紅曲米中麥角固醇的含量，mg/g；C1為由標準曲線求得的樣品濃度，μg/mL；V為皂化提取時加入甲醇的體積，mL；m為提取紅曲樣品的質量，g。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

取上述配制的四種標準溶液進行高效液相檢測，以峰面積為縱坐標，麥角固醇濃度為橫坐標，繪制標準曲線(見圖1)，進行線性回歸，回歸方程為y=0.1709x+0.3194，R2=0.9996。

圖1 麥角固醇的標準曲線Fig.1 Standard curve of ergosterol

由圖1可知，麥角固醇在10～1000 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 樣品中麥角固醇的含量

通過計算得出Fen、SD3和A13固態發酵產物中麥角固醇的含量，結果見表1。

表1 樣品中麥角固醇的含量Table 1 The content of ergosterol in the samples

由表1可知，A13和Fen固體發酵的狀態相近，兩株菌均來自于丹東家庭自制豆醬，發酵中產麥角固醇的含量高于來自山東柿餅的SD3。

3 討論

許莉等對山西康欣藥業有限公司的銀蜜片中的麥角固醇進行測定，含量在0.015 mg/g左右浮動[12]；來李娟等對山西云鵬制藥有限公司的猴頭菌片中的麥角固醇含量進行測定，含量在0.26 mg/g左右浮動[13]。這些藥品中均含有麥角固醇，其作用為降膽固醇、預防心腦血管疾病等，并廣泛存在于真菌子實體和發酵的菌絲中。檢測麥角固醇含量的方法主要有紫外分光光度法和高效液相色譜法。酵母在發酵過程中產生的代謝產物簡單，故采用簡單易行的紫外分光光度法；而紅曲霉代謝產物豐富而干擾實驗結果，現基本采用高效液相色譜法來進行含量的測定[14，15]。紅曲霉中許多菌株均能不同程度地產生麥角固醇[16]，本研究前期所獲得的3種紅曲霉麥角固醇的產量差異較大，其中Fen和A13均分離于丹東家庭自制豆醬，相同的分離基質發酵產生的麥角固醇Fen卻遠遠高于A13，而分離自柿餅中的SD3產生極其微量的麥角固醇，說明菌株間發酵產麥角固醇的能力存在著明顯的差異。麥角固醇作為新興的、重要的藥用物質，已逐漸被人們所關注。朱效剛等利用紅曲菌SJS-20發酵，并對其產麥角固醇的條件進行了優化，得到麥角固醇的最高產量為8.1 mg/g[17]。研究獲得的紫紅曲霉Fen可以通過優化發酵條件和發酵基質來提高麥角固醇的產量。

4 結論

麥角固醇為安全無害的醫藥原料，具有降血壓、降血脂、預防骨質疏松等重要的作用。本研究利用篩選到的紫紅曲霉Fen發酵制成紅曲米，通過高效液相色譜檢測，得到了含量相對較高的麥角固醇，研究為提高麥角固醇的產量，提高紅曲米的品質和藥用價值奠定了堅實的基礎。