5種市售釀造醬油風味物質及氨基酸含量分析

范霞,陳榮順

(1.南京農業大學 食品科技學院，南京 210095；2.南京農業大學 理學院，南京 210095)

醬油是中國傳統的調味品，滋味鮮美，有助于促進食欲，已經成為人們飲食中不可缺少的一種調味品[1]。由于釀造醬油生產成本高，在利益的驅使下，以配制醬油冒充釀造醬油的現象較為普遍。釀造醬油的揮發性成分種類較多，主要包括醇類、醛類、酮類、酚類、酯類和含硫化合物等。配制醬油的風味物質遠比釀造醬油少，因而醬油中的揮發性風味組分在一定程度上能反映其品質的高低。

HS-SPME/GC-MS作為一種高效的萃取、分離檢測方法，現已廣泛應用于醬油香氣成分分析領域[2-6]。氣味是體現食品質量品質的重要指標之一[7]，電子鼻能快速識別不同等級、不同品牌的醬油[8-10]。醬油組成成分復雜，除食鹽、糖類、有機酸、色素及香料等成分外，還包含多種氨基酸，根據各氨基酸的含量可以識別不同等級的醬油[11,12]。

本研究首次利用HS-SPME/GC-MS和電子鼻技術并結合氨基酸組成分析對醬油中的風味物質和游離氨基酸進行研究，為醬油的品質評價提供了一種快速、有效的檢測方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

5種市售高鹽稀態釀造醬油：1號海天特級草菇老抽；2號海天特級金標生抽；3號海天一級草菇老抽；4號海天三級鮮味生抽；5號海天特級味極鮮，均購于南京當地超市。氨基酸標準品：濃度為2.5 μmol/mL，日本日立公司；緩沖液B1、B2、B3、B4、B5，茚三酮顯色液：日本日立公司。

1.2 儀器

GC 7890A-5975C MSD氣質聯用儀 美國Agilent公司；65 μm PDMS/DVB手動SPME進樣器 美國Supelco公司；PEN3便攜式電子鼻 德國Airsense公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；分析天平 美國梅特勒-托利多公司；磁力攪拌器 精鑿科技(上海)有限公司。

2 實驗方法

2.1 HS-SPME/GC-MS法對醬油香氣成分分析

準確稱取醬油8.00 g，放入20 mL的頂空瓶中，加入氯化鈉固體1.50 g，在50 ℃下攪拌20 min，使醬油香氣充分揮發。將250 ℃下預先老化5 min的固相微萃取頭插入頂空瓶內樣品上方，固定好SPME手柄，推出纖維頭吸附60 min后取出，立即插入GC-MS儀器進樣口，在250 ℃條件下解吸附5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持5 min，先以4 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持6 min；載氣為99.999%的高純氦氣，流量為1.0 mL/min；采用不分流模式進樣。

質譜檢測條件：電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；輔助加熱溫度250 ℃。

利用NIST08質譜數據庫并結合人工解析，選擇匹配度不小于80(最大值是100)的峰對醬油的香氣物質進行定性分析，各色譜峰的峰面積與總峰面積的比值為各香氣成分的相對含量。

2.2 電子鼻對醬油主成分分析

準確稱取8.00 g醬油，置于100 mL的燒杯中，用保鮮膜封口，靜置30 min后開始用電子鼻檢測，每個樣品重復5次。

電子鼻測定條件：傳感器清洗時間為100 s；傳感器歸零時間為10 s；樣品準備時間為5 s；分析采樣時間為120 s，內部流量為400 mL/min，進樣流量為400 mL/min。

2.3 5種醬油游離氨基酸含量比較

稱取醬油樣品2.00 mL，用1 mL 10%的磺基水楊酸沉淀蛋白，最后用水定容至25.00 mL的容量瓶中。取5 mL搖勻的醬油溶液，在轉速為10000 r/min的條件下，離心10 min。然后吸取1 mL，用水稀釋至25.00 mL的容量瓶中，最后吸取1 mL過濾膜進樣。每種醬油重復3次，取平均值。

L-8900全自動氨基酸分析儀測定條件：日立鈉離子交接樹脂4.6 mm×60 mm；泵1流速0.4 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進樣體積20 μL；柱溫57 ℃，反應溫度135 ℃；檢測波長570 nm和440 nm。

2.4 數據處理

采用SPSS 18.0(IBM)和Excel軟件進行數據處理，采用電子鼻設備自帶Win muster分析軟件對115 s處G/G0值進行PCA分析。

3 結果與分析

3.1 HS-SPME/GC-MS檢測醬油中的風味物質

利用HS-SPME/GC-MS技術檢測醬油中的風味物質，5種醬油共檢測出63種香氣物質，相對百分含量結果見表1。1號特級草菇老抽的主體香氣成分是2-乙酰基吡咯、糠醇、苯乙醛、5-甲基-2-呋喃甲醇，相對含量共計79.75%。3號一級草菇老抽的主體揮發性香氣物質是2-乙酰基吡咯、糠醇、苯乙醛、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛，相對含量達81.11%。2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛是3號醬油特有的風味物質。2號金標生抽、4號鮮味生抽、5號味極鮮的主體香氣物質是乙醇和苯乙醇，相對含量分別是86.24%、70.04%、78.97%。Lee等[13]利用SPME結合GC-MS對發酵醬油和酸水解醬油揮發性風味物質進行了對比分析，得知醇類和酯類是發酵醬油中的主要物質，雜環類和酸類是酸水解醬油中的主要物質。趙謀明等[14]通過頂空-固相微萃取(HS-SPME)的方法萃取醬油的風味物質，并采用氣相色譜-質譜/嗅聞技術(GC-MS和GC-O)聯用的方法分離鑒定出11種揮發性香氣化合物，其中醇類相對百分含量達75.82%。5種醬油共同含有的香氣成分有10種，包括醇類1種，苯乙醇；雜環化合物5種，糠醇、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、3-苯基呋喃、氰化芐；酚類1種，愈創木酚；醛類3種，苯乙醛、壬醛、癸醛。

表1 醬油中的香氣成分及相對含量Table 1 Aroma components and relative content in soy sauce

續 表

續 表

注：“-”表示未檢測到或不存在。

醬油中的香氣物質根據官能團種類主要分為醇類、酚類、醛酮類、酯類、酸類、雜環化合物、含硫化合物及其他。1號特級草菇老抽、2號金標醬油、3號一級草菇醬油、4號鮮味生抽、5號味極鮮分別檢測出31，29，27，32，34種揮發性香氣物質，結果見表2。

表2 醬油中所含香氣物質分類Table 2 Classification of aroma substances in soy sauce

醇類是醬油在生產過程中由酵母酒精發酵和氨基酸降解產生的一種常見的香味物質。其中乙醇能產生令人愉快的酒香味，苯乙醇是酵母菌乙醇發酵降解苯丙氨酸的產物，具有花草和水果的香氣[15]。本研究中，醇類物質是各醬油中種類數較少且含量相差較大的一類風味物質。1，3號醬油醇類化合物相對含量較少；2，4，5號醬油，乙醇和苯乙醇作為主體成分，相對百分含量高達70.04%～86.24%。酚類物質主要是來自小麥的原料經米曲霉作用后再經酵母發酵而成的，具有香氣特征明顯、活性強的特征，對醬油風味有較大的貢獻。其中，4-乙基愈創木酚是提高醬油香氣的關鍵，為醬油帶來類似丁香和煙熏的香味[16]。2，4，5號醬油中4-乙基愈創木酚相對含量分別是0.35%、6.23%、0.48%。酯類物質香味清淡，散逸快，是醬油中種類最復雜的揮發性風味物質，主要由各種有機酸和醇類發生酯化反應而形成。5種醬油酯類化合物相對含量差距較大，在0.24%～9.36%之間。醛酮類是醬油中種類較為豐富的一類物質，醛類呈辛辣刺激性氣味，在醬油香氣中起調和作用[17]。苯乙醛是5種醬油共有的醛類化合物，具有風信子、紫丁香樣的香氣，苯甲醛是4號鮮味醬油特有的香氣成分，有似于杏仁的芳香氣味。酸類物質在醬油中含量很少，有刺激性氣味。本研究僅在4號醬油中檢出3.34%的苯甲酸。雜環類化合物共檢測出21種，包括呋喃類、吡咯類、吡嗪類化合物及氰化芐。2-乙酰基吡咯是1，3號醬油的主要香氣成分，含量分別達50.76%、44.23%。2-乙酰基吡咯帶輕微香豆素的香氣，還有茶味香味，味甜。含硫類物質可能與某些氨基酸的降解作用有關，共檢出3種。

3.2 電子鼻對5種釀造醬油的氣味分析

利用電子鼻PCA方法對5種醬油的氣味進行分析，見圖1。

圖1 不同種類醬油的PCA分析圖Fig.1 PCA analysis diagram of different kinds of soy sauce

由圖1可知，主成分PC1和PC2的貢獻率分別為97.42%和1.32%，總貢獻率達98.74%，說明可以代表醬油的整體信息。2號、4號和5號醬油之間完全沒有重疊，說明這3種醬油差異較大，相互之間很容易區分。1號特級草菇老抽和3號一級草菇老抽醬油之間有小部分重疊，說明這兩種醬油差異較小，其氣味有一定的相似性，不易區分。結合氣質聯用分析結果可知，1號和3號醬油中的揮發性物質成分較為相似。

3.3 全自動氨基酸分析儀對5種醬油游離氨基酸含量比較

采用全自動氨基酸分析儀對5種醬油中的17種氨基酸含量進行測定分析。由于質量和級別不同，醬油中的氨基酸含量也不盡相同，測定結果見表3。

表3 不同醬油中游離氨基酸的含量 Table 3 The content of free amino acids in different kinds of soy sauce g/dL

注：“-”表示未檢測到或不存在；“*”表示必需氨基酸。

谷氨酸作為特征氨基酸，根據其占總氨基酸的比例可以初步判斷是否添加了鮮味劑。釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%左右，如果超過這個比例，則認為可能是添加了谷氨酸鈉作為增鮮劑。5種醬油谷氨酸含量占總氨基酸的比例分別是51.59%、61.77%、27.02%、67.59%和60.76%，釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%左右，因此可以判斷5種醬油均添加了谷氨酸鈉作為增鮮劑，與其配料表一致。

在排除谷氨酸的干擾下，5種醬油氨基酸占氨基酸總量的比值見圖2。

不計谷氨酸含量，5種釀造醬油各氨基酸含量相對分布均勻。其中，天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量最高，占9%～13%；絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含量較均勻，占7%～9%；甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸占氨基酸總量的4%～7%；蛋氨酸、組氨酸、精氨酸含量較低，比例約在1%～4%之間。不含谷氨酸，5種醬油樣品中必需氨基酸占氨基酸總量分別為24.66%、19.61%、36.75%、16.34%、20.95%。理想蛋白質中必需氨基酸與氨基酸總量的比值為40%左右，因此，3號醬油中的氨基酸組成相對較好。

圖2 5種醬油游離氨基酸含量占氨基酸 總量的比值(不含谷氨酸)Fig.2 Ratio of free amino acids content to total amino acids content in five kinds of soy sauce (excluding glutamic acid)

4 結論

利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對5種市售釀造醬油的香氣成分進行鑒定，共檢測出63種香氣物質，不同醬油的香氣成分種類及含量存在一定的差異。1號特級草菇老抽和3號一級草菇醬油的主體風味物質是有堅果香和果香的2-乙酰基吡咯；2號金標醬油、4號鮮味生抽、5號味極鮮的主體風味物質是有特殊香氣的乙醇。根據PCA分析結果可知，5種醬油存在一定的差異，采用電子鼻可以對其進行很好地區分。采用全自動氨基酸分析儀對醬油中氨基酸的含量和組成進行分析，谷氨酸作為醬油中最主要的鮮味氨基酸，根據其含量范圍可以初步判定5種釀造醬油都添加了增鮮劑。不計谷氨酸，5種醬油各氨基酸含量相對分布均勻。其中，3號醬油中的氨基酸組成相對最好。本研究表明HS-SPME/GC-MS、電子鼻可以綜合評價醬油中的揮發性風味物質，結合氨基酸分析儀可以更全面、快速地評價醬油的品質。