應用Time-lapse研究人3PN胚胎的卵裂模式

史艷彬，馬超，余巧巧，邵小光

(大連市婦女兒童醫療中心生殖與遺傳醫學中心，大連 116000)

受精卵含有三個原核稱為3PN(tripronuclear)合子。3PN在體外受精(IVF)胚胎中的發生率是4%～7%，卵胞漿內單精子注射(ICSI)胚胎中的發生率是6%[1]。IVF過程中的3PN胚胎中，80%以上是因為雙精入卵導致；而ICSI過程中的3PN胚胎主要是卵母細胞第二次減數分裂失敗或第二極體未能排出導致[2]。

以往關于3PN的研究主要集中在染色體[3]，而不是細胞周期的時間動力學。研究發現，在80%以上的IVF 3PN胚胎中可以觀察到兩對中心粒，而ICSI 3PN胚胎中僅發現一對中心粒[4]。因為第一次有絲分裂被父源性中心粒控制，我們推測IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式可能存在差別。3PN胚胎的形態學表現與2PN胚胎相同，所以IVF周期中原核過早消失的胚胎因無法明確PN數往往被丟棄。本文通過時差胚胎監測(Time-lapse)培養箱，比較IVF 3PN與ICSI 3PN、ICSI 2PN和IVF 2PN的卵裂模式和胚胎動力學參數，為避免錯誤地丟棄具有發育潛能的胚胎提供理論依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年7月至2018年6月就診于大連市婦女兒童醫療中心的生殖與遺傳醫學中心接受輔助生殖技術(ART)助孕并同意將胚胎放置Time-lapse培養箱中培養監測的患者142例。

納入標準：2PN組胚胎來源于受精卵全部是2PN(本周期沒有3PN、1PN、0PN)的患者，3PN組胚胎來源于受精卵至少有一個3PN的患者；年齡≤38周歲；ART次數<3次。排除標準：卵巢功能儲備下降；FSH>20 U/L；子宮內膜異位癥；PCOS患者；男方嚴重少弱畸精子癥；補救顯微受精患者。排除未分裂合子、5細胞以下和碎片>20%的胚胎。

二、研究方法

1.分組：根據受精方式及受精結果分為4組：IVF 2PN組(n=150)、ICSI 2PN組(n=100)、IVF 3PN組(n=132)、ICSI 3PN組(n=11)。

2.IVF和胚胎培養：常規超促排卵、陰道經B超引導下采卵、獲得的卵冠丘復合物在培養箱中培養2～6 h后，依據治療指征給予IVF或ICSI受精。ICSI受精后立即放置Time-lapse三氣培養箱中(ESCO Miri-TL，丹麥)連續培養；IVF精卵共培養置于三氣培養箱中(Labotect C200，德國)，短時受精推測受精后放置Time-lapse三氣培養箱中繼續培養。所有胚胎使用一步培養液(global total LP，美國)培養，2PN胚胎培養至D3天移植或冷凍，3PN胚胎培養至八細胞以上。

3.Time-lapse監測和評估：平均每10 min圖像被記錄一次。對于ICSI胚胎，精子注入卵母細胞的時間定義為t0；對于IVF胚胎，卵母細胞加入調好濃度的精液盤中的時間定義為t0。所有關鍵時間點和分裂模式在Time-lapse軟件系統下被同一觀察者定義。記錄卵裂模式、原核出現的時間、原核消失的時間、第一次卵裂的時間、t4(從1-細胞分裂成4-細胞的時間)、t3-t5(從3-細胞分裂成5-細胞的時間)。

三、統計學處理

結果

一、各組胚胎卵裂模式比較

IVF 3PN胚胎組79.55%(105/132)直接分裂成4-細胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-細胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-細胞，0.77%(1/132)直接分裂成6-細胞；IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎組異常分裂模式主要為直接分裂成3-細胞。

統計結果顯示：IVF 3PN胚胎分裂成2-細胞比率顯著低于其余3組(P<0.001)，IVF 3PN胚胎直接分裂成4-細胞的比例顯著高于其余3組(P<0.001)；而IVF 3PN和IVF 2PN胚胎、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎直接分裂成3-細胞比率無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常比率比較

IVF 3PN胚胎第一次卵裂模式異常率、在28 h發育到4-細胞的比率以及t3-t5<11 h的胚胎比率均顯著高于其余3組(P<0.001)；而IVF 3PN胚胎在23 h發生第一次卵裂的比率顯著低于其余3組(P<0.001)(表2)。

三、各組胚胎動力學參數比較

IVF 3PN胚胎原核消失的時間、第一次卵裂時間均顯著長于其余3組(P<0.05)； IVF 3PN胚胎分裂成4-細胞的時間(t4)及從3-細胞到5-細胞(t3-t5)的時間均顯著短于其余3組(P<0.05)；IVF 2PN、ICSI 3PN和ICSI 2PN之間的卵裂動力參數均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂模式比較[n(%)]

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.001

表2 IVF 3PN胚胎與IVF 2PN、ICSI 3PN、ICSI 2PN胚胎卵裂異常率比較[n(%)]

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.001

表3 各組胚胎的動力學參數比較(-±s)

注：與IVF 3PN組比較，*P<0.05

討論

部分研究者通過第2天觀察IVF 3PN合子有絲分裂的過程發現了部分合子直接分裂成3-細胞的現象。Kola等[5]報道了29個IVF 3PN合子中，18個(62%)直接分裂成3-細胞；Balakier[6]報道了32個IVF 3PN合子中，6個(19%)直接分裂成3-細胞；Pang等[7]報道了32個IVF 3PN合子中，7個(22%)直接分裂成3-細胞。然而，這些報道都是傳統的非連續性的胚胎評估。Staessen等[8]報道了ICSI 3PN合子有絲分裂的過程發現：第2天胚胎處于2-細胞或4-細胞階段，研究還比較了IVF和ICSI 3PN在第2天的細胞數，發現二者沒有統計學差異。與既往研究的胚胎培養方式不同，我們使用Time-lapse培養箱發現IVF 3PN中的79.55%(105/132)直接分裂成4-細胞，18.94%(25/132)直接分裂成3-細胞，0.76%(1/132)直接分裂成5-細胞，0.76%(1/132)直接分裂成6-細胞。我們也觀察到IVF 3PN分裂成3-細胞比率略高于ICSI 3PN，但無統計學差異(18.94% vs.18.18%，P=0.95)。

中心粒和其周圍的基質組成了有絲分裂的紡錘體。1994年，Palermo等[9]研究證明精子的中心粒控制著合子的第1次有絲分裂。二精入卵可能會在合子中形成兩對中心粒，如果合子中過度的中心粒不休眠，那么過度的中心粒就有可能使合子卵裂異常：直接分裂成3-細胞[10]。因此，我們推測這就是IVF 3PN直接卵裂成3-細胞以上的發生率要顯著高于IVF 2PN、ICSI 2PN和ICSI 3PN的原因。但是在Time-lapse下不能直接觀察到中心粒和紡錘體結構，因此不能得到最終的結論。

然而，多余的父源性中心粒影響卵裂的假說卻不能解釋部分正常2PN和部分ICSI 3PN也可能直接卵裂成3-細胞。 推測可能是卵孤雌激活會形成一個沒有中心粒的紡錘體極，再與一個正常的中心粒結合就可能形成第3個紡錘體[11]；也有可能是父源性中心粒在第1個細胞周期的S期發生加倍復制，或者精子中攜帶兩對中心粒[12-13]。目前已經有研究發現2PN胚胎直接卵裂成3-細胞的植入率顯著低于正常卵裂模式的胚胎[14]。第3個紡錘體極形成的原因以及如何形成的將有待于進一步研究。

我們還發現IVF 3PN第1個細胞周期顯著長于IVF 2PN[(27.06±1.59)h vs.(22.64±1.38)h](P=0.04)。推測可能是相比2PN胚胎，3PN胚胎的有絲分裂紡錘體結構更復雜。因為紡錘體的三級結構，有絲分裂的微管可能在3個位點連接在著絲粒，從而形成異常的“Y”字形赤道板，使得3PN胚胎需要更長的時間發生卵裂。本研究中，盡管ICSI 3PN直接分裂成3-細胞的比例高于ICSI 2PN(18.18% vs.11.00%，P=0.09)，但是ICSI 3PN第1次卵裂的時間與ICSI 2PN相比無統計學差異[(22.32±1.56)h vs.(22.78±1.66)h](P=0.82)。雖然我們的研究數量有限，但是可以推測IVF 3PN與ICSI 3PN異常卵裂的原因不同。ICSI 3PN直接卵裂成3-細胞可能是合子先直接分裂成2-細胞，其中1個卵裂球沒有發生DNA和中心粒的復制就迅速發生分裂，并沒有形成耗時的“Y”字形赤道板。

受顯微鏡技術發展的限制，3PN胚胎的發生機制還不清楚：是由于皮質反應缺陷導致雙精入卵，還是卵源性/精源性減數分裂錯誤導致雙雌受精/雙雄受精?國外學者新開發的顯微鏡技術——激光層片掃描顯微技術(Light sheet Microscopy technology，LSMT)[15]，依賴其高速和空間精度大大減少了胚胎接觸的光毒性和光漂白性，并且具有非常高的時間分辨率的特性能夠對胚胎發育早期階段進行實時、3D成像。期待應用該技術可以早日揭示3PN胚胎的發生和異常卵裂的機制。