改良法處理人脫細胞真皮的脫細胞效果及其與體外細胞的相容性研究

鄧霞　鐘惠蘭

[摘要]目的：研究經改良法處理后的人脫細胞真皮的脫細胞效果及其與體外細胞的相容性。方法：分別使用傳統方法與改良方法脫去健康人皮膚的細胞成分，觀察兩種方法制備的脫細胞真皮的外觀、HE染色結果、脫細胞效率、膠原纖維的完整度、體外降解時間、孔隙率、孔腔直徑、細胞毒性及體外細胞相容性，并進行對比分析。結果：改良法制備的脫細胞真皮柔韌度更好，塑形性更高;經HE染色后，改良法制備的真皮孔隙均勻、結構疏松、膠原纖維較傳統方法更為纖細;改良法制備的脫細胞真皮的孔隙率及真皮網狀面孔隙直徑均優于傳統方法，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）;兩組脫細胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時間比較差異無統計學意義（P>0.05）;改良方法制備的脫細胞真皮8d內連續檢測結果均顯示無細胞毒性。經改良法制備的脫細胞真皮上的干細胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時間增加而擴大，細胞數量明顯增加，而傳統方法制備的脫細胞真皮無明顯浸潤現象。結論：改良方法不僅操作簡單，且制備的脫細胞真皮的脫細胞效果較好，無細胞毒性，體外相容性更佳。

[關鍵詞]脫細胞真皮;相容性;改良法;體外細胞;孔隙率

[中圖分類號]R329.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）10-0102-03

Abstract： Objective? To study the acellular effect of human acellular dermis treated by modified method and its compatibility with cells in vitro. Methods The appearance， HE staining results， acellular efficiency， integrity of collagen fibers， degradation time in vitro， porosity， pore diameter， cytotoxicity and cytocompatibility of acellular dermis prepared by the two methods were observed and compared. Results? The modified acellular dermis had better flexibility and higher plasticity. After HE staining， the improved acellular dermis had uniform pore， loose structure and finer collagen fibers than the traditional method. The porosity and pore diameter of the acellular dermis prepared by the improved method were better than the traditional method， and the difference between the two groups was significant （P<0.05）. There was no significant difference in basal pore diameter and degradation time in vitro （P>0.05）. The acellular dermis prepared by the improved method showed no cytotoxicity within 8 days. Stem cells infiltrated the basal layer of the acellular dermis prepared by the improved method， and the infiltration range increased with time， and the number of cells increased significantly. However， the acellular dermis prepared by the traditional method had no obvious infiltration. Conclusion? The modified method is not only simple in operation， but also has better acellular effect， no cytotoxicity and better compatibility in vitro.

Key words： acellular dermis; compatibility; improved method; in vitro cell; porosity

無論是天然牙還是種植牙，牙齦缺損、過窄或過薄，都對美觀性產生影響，且不利于牙周健康。而脫細胞真皮是一種很好的牙齦替代物，能夠修復或重建天然牙、種植牙及義齒周圍牙齦的寬度及厚度[1]，幫助患者重新恢復功能及美觀性。脫細胞真皮是一種僅具有真皮基質，且完整保留了細胞外基質的結構及形態、成分及基底膜等，為種子細胞的生長與分化提供所需環境的理想的支架材料[2]。脫細胞真皮能夠將供體皮膚中易引起排斥反應的成纖維細胞、血管內皮細胞等成分脫出，僅保存完整的低抗原性細胞外基質成分，且其獨有的三維結構為細胞提供了一個生長代謝的立體框架，使細胞外基質蛋白能促進表皮細胞的附著與增生，促進細胞相容性，使組織的生理性修復得到完成[3]。研究顯示，脫細胞真皮具有良好的生物相容性、極低的抗原性、快速血管化及較高穩定性的特點[4]，能夠促進機體表皮的再生及修復[5]。生物相容性是生物材料貫穿始終的主題，對生物醫用材料而言，脫細胞真皮的生物相容性直接決定了材料的應用效果。脂肪干細胞是組織工程中廣泛應用的一種種子細胞[6]。Ribeiro等使用異種脫細胞真皮對拔牙后的軟組織創面進行修補，取得良好效果[7]。Basegmez等研究結果顯示，脫細胞真皮不僅不影響種植體與骨的結合，且手術創傷小、修復效果及美觀性良好[8]。但現有的脫細胞真皮方法復雜，且盡管去除了毛發、腺體、血管后，殘留有部分腔隙，但是孔隙率仍較低，細胞滲透性差，影響宿主細胞及血管的生長。本次實驗采用改良方法進行脫細胞真皮的制備，并將傳統方法與改良方法制備的脫細胞真皮的脫細胞效果及體外細胞相容性進行對比，現將結果報道如下。

1? 材料和方法

1.1 材料：選取本院整形外科行常規皮膚移植術后多余的臀部皮膚組織作為皮膚樣本，入選者年齡24～44歲，均無傳染性疾病及皮膚病變等。本次研究經筆者醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 脫細胞真皮的制備[9]：①傳統法：無菌狀態下將所選皮膚組織的皮下脂肪減除，放入1mol/L的氯化鈉溶液（上海玉博生物科技有限公司）中37℃作用24h，然后除去表皮，放入2%的氫氧化鈉溶液中37℃進行搖床處理16h，使用鏈霉素磷酸鹽緩沖液（PBS，上海遠慕生物科技有限公司）將溶液沖洗至中性。將所得皮片按照-80℃冷凍、37℃水浴箱復溫、洗滌，反復凍融4次，每次4h。完成后使用冷凍干燥機凍干，將所得脫細胞真皮4℃密封備用;②改良法：將所選皮膚組織的皮下脂肪組織在無菌狀態下剪除，放入1mol/L的氯化鈉溶液中37℃作用24h將表皮去除，然后放入2%的氫氧化鈉溶液中45℃進行搖床處理4h，使用PBS將溶液沖洗至中性。進行冷凍干燥后4℃密封備用。

1.2.2 染色：兩種方法均先使用4%的多聚甲醛固定24h，再用石蠟包埋，然后進行切片、HE染色，用樹脂進行封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 性狀檢測：①孔隙率：將脫細胞真皮冷凍干燥后，進行稱重（W1）;加入50ml 75%的乙醇離心管，抽真空至不再有氣泡溢出，連同含有乙醇及支架材料的離心管一起進行稱重（W2）;將含有乙醇支架材料取出，對剩余的乙醇及離心管稱重（W3）;所有稱重結果均精確至0.001g?？紫叮≒）率：P（%）=（W2-W3-W1）/（W2-W3）×100%;②體外降解時間：稱取冷凍干燥后的脫細胞真皮0.02g，使用1.0ml膠原酶37℃滴入，記錄消化至液體完全澄清所用時間;③孔腔直徑：使用3%的戊二醛將脫細胞真皮固定4℃過夜，然后使用PBS進行沖洗，每次10min，連續3次，使用梯度乙醇+六甲基二硅氨烷脫乙醇進行脫水后，進行冷凍、干燥、噴金，拍照記錄，使用Image J測量孔隙直徑;④細胞毒性：參照《醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性實驗》中的方法提取脫細胞真皮浸潤液。3cm2表面積（雙面）加入1ml RPMI1640+10% FBS培養基，加入二氧化碳培養箱孵育24h后收集浸潤液;體積比0.64%苯酚作為陽性對照，聚乙烯浸潤液作為陰性對照，RPMI1640+10% FBS則作為空白對照;將5×104/ml的P3脂肪干細胞以100μl接種于96孔板，常規培養24h后再以陽性、陰性及空白三組浸潤液以100μl/孔進行培養，并連續8d使用MTT法對細胞增殖活性進行檢測，每日檢測4孔/組。

1.3 細胞毒性的評價標準：根據《非直接接觸血液的醫用生物材料生物性能測試標準》中的6級毒性分級法進行評定：0級，細胞相對增殖率（RGR）≥100%;1級，RGR為75%～99%;2級，RGR為50%～74%;3級，RGR為25%～49%;4級，RGR為1%～24%;5級，RGR為0%。評分在2級及2級以上者，說明材料存在細胞毒性[10]。

1.4 細胞相容性：以每孔2×104個細胞將P4脂肪干細胞接種于浸泡過完全培養基48h的脫細胞真皮中，孵育8d后用甲醛進行固定，使用HE染色后觀察兩種脫細胞真皮上脂肪干細胞生長及浸潤程度。

1.5 觀察與評價指標：觀察兩種方法制備的脫細胞真皮的外觀、染色結果、孔隙率、孔腔直徑、體外降解時間及細胞毒性，并進行對比分析;對比兩種方法制備的脫細胞真皮的體外相容性。

1.6 統計學分析：應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料用（x?±s）表示，使用t檢驗;計數資料用率（%）表示，使用χ2檢驗;不同濃度脫細胞真皮浸潤液及空白對照吸光度間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 外觀比較：兩種方法制備的脫細胞真皮經肉眼觀察顏色無差異，均呈乳白略帶微黃色;但改良法制備的真皮表面可見孔隙，柔韌度更好，塑形性更高，更利于手術操作。

2.2 染色結果比較：經HE染色后，兩種脫細胞真皮細胞成分均被完全脫去，均未見藍染細胞核及殘留，膠原纖維均完整，且較傳統方法，改良法制備的真皮孔隙均勻、結構疏松、膠原纖維更為纖細。

2.3 兩種脫細胞真皮的孔隙率、孔腔直徑及體外降解時間比較：改良法制備的脫細胞真皮的孔隙率及真皮網狀面孔隙直徑均優于傳統方法，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）;但改良法脫細胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時間與傳統法比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.4 改良法脫細胞真皮的細胞毒性：改良方法制備的脫細胞真皮8d內陽性對照組、陰性對照組及空白對照組的脫細胞真皮的連續檢測結果均顯示無細胞毒性。見表2。

2.5 體外細胞相容性：將P4脂肪干細胞接種于經兩種不同方法制備后的脫細胞真皮上，8d后傳統法制備的脫細胞真皮的基底膜面呈現單層-復層生長，無明顯浸潤現象;8d后改良法制備的脫細胞真皮上的干細胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時間增加而擴大，細胞數量明顯增加。

3? 討論

脫細胞真皮基質是一種經過特殊方式去除皮膚組織內細胞及抗原而保留細胞外基質的生物材料[11]。研究證實，脫細胞真皮夠為細胞的生長及細胞外基質的重建提供良好的環境，提高移植的成活率，降低創面收縮率，減輕瘢痕攣縮[12]。目前脫細胞真皮已廣泛應用于整形外科、眼科、口腔科及燒傷科等臨床學科[13]。邵小均等[14]研究結果證實，脫細胞真皮在口腔頜面部各類創面的修復中起到創面覆蓋、引導組織再生和支架的作用。時長江等[15]研究證實，在治療各種創面的修復過程中，將脫細胞真皮作為載體，聯合種子細胞治療各種創面的修復及組織重建，亦取得良好效果。陳武等[16]研究證實，牙周膜細胞在脫細胞真皮表面黏附及增殖情況良好。組織相容性是衡量生物材料的重要指標之一，而制備的脫細胞真皮的孔隙率、通透性等均會對細胞的浸潤生長產生影響。因此制備脫細胞真皮的各種方法的重點均是盡量去除皮膚組織的細胞成分，提高脫細胞真皮的相容性。另外據報道，脫細胞真皮的孔隙率、孔腔大小及各種細胞因子等都會對脫細胞真皮的血管化產生影響[13]。

張愛君等[17]研究證實，通過調節制備過程中堿液的濃度能夠有效調節脫細胞真皮的微結構，使其孔腔直徑與孔隙率增大，而冷凍處理則可以使細胞外基質更加疏松。本次實驗結果顯示，傳統方法與改良方法制備的脫細胞真皮經肉眼觀察顏色無差異，均呈乳白略帶微黃色，但經改良法制備的真皮表面可見孔隙，柔韌度更好，塑形性更高，更利于手術操作;而經HE染色后，兩種脫細胞真皮細胞成分均被完全脫去，均未見藍染細胞核及殘留，膠原纖維均完整，且較傳統方法，改良法制備的真皮孔隙均勻、結構疏松、膠原纖維更為纖細;且改良法制備的脫細胞真皮的孔隙率及真皮網狀面孔隙直徑均優于傳統方法，組間比較差異有統計學意義。說明相對傳統法而言，改良法制備的脫細胞真皮更利于細胞的浸潤生長。兩組脫細胞真皮的基底層孔隙直徑及體外降解時間比較差異無統計學意義;改良方法制備的脫細胞真皮8d內連續檢測結果均顯示無細胞毒性，說明經改良法制備的真皮安全可靠。筆者將P4脂肪干細胞接種于經兩種不同方法制備后的脫細胞真皮上，8d后傳統法制備的脫細胞真皮的基底膜面呈現單層-復層生長，無明顯浸潤現象;而改良法制備的脫細胞真皮上的干細胞浸潤基底層，且浸潤范圍隨時間增加而擴大，細胞數量明顯增加。結果與姜濤等[18]研究一致，說明改良方法去除細胞更徹底，制備的脫細胞真皮的體外相容性及臨床使用效果更好。

綜上所述，應用改良方法制備的脫細胞真皮，不僅方法簡單，且制備出的脫細胞真皮質地更利于手術操作，孔隙率及孔腔直徑均優于傳統方法，且無細胞毒性，與體外細胞的相容性較傳統方法亦更佳。

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[收稿日期]2019-02-20

本文引用格式：鄧霞，鐘惠蘭.改良法處理人脫細胞真皮的脫細胞效果及其與體外細胞的相容性研究[J].中國美容醫學，2019，28（10）：102-105.