醬醪pH值調控對高鹽稀態醬油品質的影響

方璐怡，周文斯，鄭雪君，崔春*，李齡佳，許立鏘

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640； 2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000)

醬油是以大豆(豆粕)和小麥等為主要原料，添加米曲霉固態制曲和液態醬醪發酵制備的一種色、香、味俱全的液體調味品。液態醬醪釀造過程中，各種微生物的生理代謝和酶系的生化作用，使原料中蛋白質、淀粉、油脂等大分子被分解為小分子肽、游離氨基酸、有機酸等小分子物質，賦予醬油豐富飽滿的滋味和獨特的香氣[1,2]。醬醪pH是影響醬油品質的重要因素，微生物和酶的生化催化或轉化作用均有一個最適的pH值范圍，超過這個范圍微生物和酶的活力會受到抑制[3]。調控醬醪的pH值可以明顯改變醬醪的pH環境，進而影響醬油的質量。pH值對酶解反應有重要影響。孫方達等[4]和康樂等[5]發現pH對豬骨蛋白水解物和牛肉酶解的美拉德反應有影響，pH在5.0～6.5條件下，隨著pH升高，美拉德反應速率提高，總游離氨基酸、鮮味氨基酸含量增加，小于1 kDa的肽段含量上升，酶解體系的醇厚感和香氣顯著增加。但系統研究醬醪pH值對高鹽稀態醬油釀造過程中滋味物質形成的動態變化的報道仍比較少。

本文在醬醪初期低溫脅迫發酵下，全面監測不同pH的值發酵的高鹽稀態醬油在發酵過程中各種理化指標的動態變化，通過分析醬醪釀造過程中的谷氨酰胺酶活力、中性蛋白酶活力、總氮、氨基酸態氮、醬油的肽分子量分布和滋味感官品質的情況，系統研究不同醬醪pH值的醬油在釀造過程中滋味物質的釋放規律，旨在為調味品行業提高醬油的品質以及實現醬油發酵的代謝調控提供理論依據和方法指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)：山東市濟寧玉園生物科技有限公司；低溫食用豆粕：山東市禹王實業(集團)有限公司；原料面粉、食鹽：均為市售。

1.2 試驗試劑

十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、濃硫酸、檸檬酸(一水)、三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、甲醛及苯酚：均為分析純；谷氨酰胺、酪蛋白及福林酚試劑：均為生化試劑；肽分子量標品：色譜純，購自美國Sigma公司。

1.3 試驗主要儀器設備

HYP-308 消化爐、KDN-103F 自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；Bante 321-NH4銨離子選擇電極 上海般特儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江陰市保利科研器械有限公司；ME204E 分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；高效液相色譜儀 美國Waters公司；TS100 微型旋渦混合儀器 杭州瑞誠儀器有限公司；DHG-9070A鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；GL21M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；ZXJP-A1430 霉菌培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 主要工藝流程

本文采用高鹽稀態醬油釀造方法(GB 18186-2000)進行發酵，按1∶2.5(大曲∶水)混合均勻后，在4 ℃冰箱進行醬醪發酵初期(9 d)的控溫發酵，然后與16%(W/W)的鹽混合，放在25 ℃的恒溫發酵箱中進行保溫發酵[6,7]。其中一部分每2～3 d用10 mol/L NaOH調控醬醪pH值在6.5左右，為調控pH醬醪；另外一部分在自然pH值下進行發酵，為自然pH醬醪。醬醪發酵的總周期為90 d。醬油制備的主要工藝流程見圖1。

圖1 醬油制備工藝流程圖Fig.1 Flow chart of soy sauce preparation process

1.4.2 谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的測定

參考崔春等[8]和Nannipieri等[9]的方法，采用離子選擇電極法測定谷氨酰胺酶活力。參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活力。

1.4.3 總氮和氨基酸態氮的測定

參照國家標準GB 18186-2000《釀造醬油》，采用凱氏定氮法測定樣品中的總氮含量，采用甲醛滴定法測定氨基酸態氮含量。

1.4.4 水溶性分子肽的分子量分布

采用凝膠色譜法測定肽分子量的分布。檢測條件為Waters 600型高效液相色譜儀，TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜分析柱；洗脫液為含有0.1%三氟乙酸的磷酸鹽緩沖液，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm。標準肽樣品相對分子質量的對數值與洗脫體積擬合直線方程為y=-0.351x+7.677(R2=0.9921)，式中：y為標準肽分子量的對數；x為保留時間。

1.4.5 感官評價分析

采用定量描述分析(QDA)方法[10,11]。感官評定小組由7名男生和5名女生(年齡在25～45歲)組成，評價前對每位評價人員進行多次風味描述一致性的認定培訓。感官測評的標準溶液為5種：甜味(蔗糖，1%)、咸味(氯化鈉，0.7%)、鮮味(谷氨酸鈉，0.35%)、苦味(L-異亮氨酸，0.5%)、酸味(檸檬酸，0.08%)。感官評價采用九點線性標度法，0～9分分別表示無感覺、閾值感覺、感覺微弱、感覺中等、感覺強烈，采用雷達圖描述評價結果。

1.5 數據分析

試驗結果以兩組發酵樣平均數±標準差來表示，所有試驗均重復3次，使用SPSS 16.0和Excel 2016軟件分析數據并繪制相應圖表。

2 結果與討論

2.1 不同醬醪pH值發酵過程濾液和濾渣中谷氨酰胺酶活力的變化

谷氨酰胺酶是醬油釀造過程中的關鍵酶，可作用于谷氨酰胺酶解生成鮮味氨基酸(谷氨酸)，達到增強醬油鮮味的目的[12]。因此，釀造過程中保持或提高谷氨酰胺酶的活力相當重要。

圖2 不同醬醪pH發酵過程濾液和濾渣中 谷氨酰胺酶活力的變化Fig.2 Changes of glutaminase activity in filter liquor and filter residue during fermentation with different pH values of soy sauce mash

由圖2a可知，隨發酵時間的延長，兩個醬醪樣品濾液中的谷氨酰胺酶活力均呈現先快速降低(發酵1～20 d)后緩慢降低(20～50 d)的變化，調控pH>自然pH，且差異顯著(P<0.05)。在發酵第20天時，調控pH濾液的谷氨酰胺酶活力為142.5 U/g，約為初始的1/2.5，是自然pH的1.82倍。在第50天時，自然pH濾液的谷氨酰胺酶活力消失，而調控pH濾液還保持著一定的酶活力。發酵50～90 d，調控pH濾液的谷氨酰胺酶活力繼續緩慢下降，直至90天時酶活消失。醬醪濾液中的谷氨酰胺酶主要包括細胞外、細胞表面和可溶性胞內酶。谷氨酰胺酶水解反應的最適pH值為7.0，pH在7.0～9.0范圍內均保持較高的水解活性。通過10 mol/L NaOH堿溶液持續調節控制醬醪pH值在6.5附近，當醬醪pH接近中性時，谷氨酰胺酶活力越強，發揮作用的時間越長。

由圖2b可知，濾渣中谷氨酰胺酶活力的變化趨勢與濾液中的變化趨勢相似，也呈現出先快速下降后緩慢下降，最后趨于消失的變化趨勢。整體上，濾渣中調控pH的谷氨酰胺酶活力大于自然pH的谷氨酰胺酶活力。濾渣中的谷氨酰胺酶主要為不溶性的胞內酶。隨著發酵時間延長，微生物的新陳代謝作用產生多種有機酸，韓銘海等[13]通過篩選獲得一株高產谷氨酰胺酶菌株，其產酶的最適pH為6.2，在pH<5.8或pH>6.8時，谷氨酰胺酶活力顯著下降，這與我們的試驗結果基本一致。所以，在發酵時適當調整醬醪的pH值，可以保持谷氨酰胺酶活力。

2.2 不同醬醪pH值發酵過程中蛋白酶活力的變化

醬醪體系呈中性或弱酸性，釀造過程中中性蛋白酶可以分解蛋白質產生很多呈味的小分子肽，對改善醬油風味起到一定的作用。

圖3 不同醬醪pH發酵過程濾液中 中性蛋白酶活力的變化Fig.3 Changes of neutral protease activity in filter liquor during fermentation with different pH values of soy sauce mash

由圖3可知，兩個樣品的中性蛋白酶活力均呈現出先急速下降后緩慢下降的趨勢。發酵0～1 d，不同醬醪pH發酵過程濾液中的中性蛋白酶活力均迅速下降(P<0.05)，但降幅相似。發酵1～10 d，低溫脅迫、無鹽發酵下，微生物得到充分的生長，各醬醪pH發酵的蛋白酶活力有輕微的提高。發酵10～90 d，蛋白酶活力下降緩慢，樣品間差異顯著(P<0.05)。至發酵90 d，酶活力很弱，這可能與中性蛋白酶對不同醬醪pH的適應程度不同有關。

2.3 不同醬醪pH值發酵過程中醬油全氮和氨基酸態氮的變化

醬油是在微生物和酶的作用下，將原料蛋白質、淀粉水解成小分子肽、小分子糖、氨基酸等產物的調味品。全氮和氨基酸態氮反映了蛋白質利用率的高低，代表著原料利用程度的好壞以及氨基酸生成率的高低，是評價原料發酵程度以及醬油等級品質的重要指標。

圖4 不同醬醪pH發酵過程中醬油全氮和 氨基酸態氮的變化Fig.4 Changes of total nitrogen and amino acid nitrogen in soy sauce during fermentation with different pH values of soy sauce mash

由圖4a可知，不同醬醪pH發酵過程中醬油的全氮呈現先快速增長后緩慢增長的變化趨勢。大曲入桶發酵第1～10 d，調控pH和自然pH的全氮含量迅速上升(P<0.05)，但升幅相似，上升到1.63 g/dL和1.64 g/dL，約為初始的2倍。發酵10～90 d，全氮含量增長緩慢，基本上10 d后全氮含量較穩定，無顯著增加，兩個發酵pH的醬油無顯著性差異(P>0.05)。至發酵第60天和第90天，調控pH的全氮含量分別為1.61 g/dL和1.67 g/dL，而自然pH的全氮含量分別為1.60 g/dL和1.65 g/dL，均達到GB 18186-2000《釀造醬油》中特級醬油的標準(≥1.50 g/dL)。

由圖4b可知，不同醬醪pH發酵過程中醬油氨基酸態氮與全氮變化規律基本一致，發酵初期快速上升(0～10 d)，發酵后期緩慢增加趨于穩定。整個發酵過程中，氨基酸態氮含量為調控pH>自然pH，說明調控醬醪pH在6.5附近能夠輕微提升醬油的氨基酸態氮。至發酵第90天，調控pH和自然pH的氨基酸態氮含量分別為0.86 g/dL和0.85 g/dL，均達到GB 18186-2000《釀造醬油》中特級醬油的標準(≥0.80 g/dL)。

全氮和氨基酸態氮含量與醬油最終產品的品質緊密相關。發酵1～10 d，不同醬醪pH發酵醬油的全氮和氨基酸態氮含量快速增長，10 d后緩慢增加，趨于穩定。這一結果與鄧沖等[14]和姚玉靜等[15]所報道的研究結果一致。導致發酵初期全氮和氨基酸態氮含量快速增加的原因主要是：醬醪發酵初期低溫脅迫和無鹽條件下發酵，各種微生物快速生長，其產酶系活力旺盛，蛋白質和肽類的酶解反應劇烈。其中，酶系的生化作用對醬油發酵極為重要。由圖2和圖3可知，發酵后期谷氨酰胺酶和蛋白酶活力較低，從而降低了全氮和氨基酸態氮的生成速率。此外，發酵期間的美拉德反應和微生物的新陳代謝也會消耗一定量的全氮和氨基酸態氮。

2.4 不同醬醪pH發酵醬油成品的肽分子量分布

不同醬醪pH發酵醬油的肽分子量分布見表1。至發酵第90天，>10 kDa肽段占整體比例較小，且自然pH>調控pH，具有顯著性差異(P<0.05)，這表明在調控醬醪pH發酵下，大分子量的肽段減少而生成更小分子的肽段。5～10 kDa肽段所占整體比例最小，僅有9.34%和11.59%。其中，3～5 kDa肽段所占整體比例最大，3～5 kDa肽段含量為調控pH >自然pH，差異顯著(P<0.05)。其次為1～3 kDa肽段，所占整體比例較大，調控pH>自然pH，差異顯著(P<0.05)。

總體上，兩種樣品的肽分子量主要集中于1～5 kDa肽段，所占比例在50%以上，調控pH>自然pH，樣品間差異顯著(P<0.05)。這可能是不同醬醪pH發酵樣品的各種酶活力差異所致。調控醬醪pH至6.5附近發酵，酶活較高，作用發揮充分，將>5 kDa的肽段降解為更多1～5 kDa肽段。隨發酵時間的增加，自然pH樣品的醬醪pH不斷下降到5.0以下，從而抑制了部分酶的活力，使得>5 kDa的大分子量肽段更易被保留，從而生成更少1～5 kDa的小分子肽段。

表1 不同醬醪pH發酵90 d后醬油的肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of peptides in soy sauce after fermentation for 90 d with different pH values of soy sauce mash

注：所有參數結果均為平均值±標準偏差(n=3)；游離氨基酸同行中標注不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

小分子肽是醬油中重要的呈鮮物質，小分子肽的含量越高，醬油的鮮味越強，感官品質越好。Ogasawara等[16]通過實驗發現1～5 kDa肽段的美拉德反應產物具有良好的呈味特性，可以有效增強清湯和鮮味溶液的持續性、濃厚感和鮮味特征。此外，康樂等研究發現pH值(5.0～6.5)可以明顯改善牛肉酶解物美拉德反應產物風味，隨著pH增加，小分子肽段含量上升，說明pH值的增大使肽類的降解速率加快。因此，調控醬醪pH在6.5附近，可以加快肽的降解速率，從而增加醬油中的小分子肽含量，達到提升醬油感官滋味的目的。

2.5 不同醬醪pH發酵醬油成品的滋味感官分析

圖5 不同醬醪pH發酵90 d后醬油的滋味感官評定Fig.5 Sensory evaluation of soy sauce after fermentation for 90 d with different pH values of soy sauce mash

由圖5可知，不同醬醪pH發酵的醬油的滋味有明顯差異，其中調控pH的鮮味、厚味、咸味最為突出，苦味最弱；自然pH的甜味較為突出，鮮味、厚味也較好，但有較強的苦味。整體上，調控醬醪pH在6.5附近發酵的醬油比自然醬醪pH下發酵的醬油滋味更加濃郁。這一結果與余自琳等[17]研究pH對墨魚酶解物美拉德反應產物風味的影響基本一致。余自琳等發現pH在5.0～7.0條件下，隨著反應pH升高，游離氨基酸含量由5.73 mg/mL增加至6.30 mg/mL，其中鮮味、苦味氨基酸含量均有增加；美拉德反應產物鮮味、甜味突出，苦味和腥味逐漸降低。因此，調控醬醪pH在6.5附近發酵醬油，能夠有效提高醬油的感官滋味，尤其是鮮味和濃厚感。

3 結論

不同醬醪pH發酵的醬油其谷氨酰胺酶、蛋白酶活力差別顯著(P<0.05)。隨著發酵時間的延長，醬醪pH不斷下降至5.0以下，谷氨酰胺酶和蛋白酶活力均不斷降低。持續調控醬醪pH在6.5附近，處于谷氨酰胺酶和蛋白酶的最適pH范圍，有利于保留酶的活力，使原料分解得更充分。兩個醬醪pH發酵的醬油其全氮、氨基酸態氮均在發酵初期快速上升，樣品間無顯著性差異(P>0.05)。至發酵第90天，調控pH和自然pH的全氮、氨氮均達到了特級醬油的標準(全氮≥1.50 g/dL，氨基酸態氮≥0.80 g/dL)。不同醬醪pH發酵的醬油其肽分子量分布主要集中于1～5 kDa(>50%)，不同肽段所占比例不同。至發酵第90天，調控pH發酵醬油其大于5 kDa肽段所占比例低于自然pH發酵醬油，而具有重要呈味作用的1～5 kDa肽段所占比例高于自然pH發酵醬油，且差異顯著(P<0.05)。不同醬醪pH發酵的醬油的滋味有明顯差異，調控pH的鮮味、厚味、咸味最為突出，苦味最弱；自然pH的甜味較為突出，鮮味、厚味也較好，但有較強的苦味。調控醬醪pH在6.5附近發酵的醬油相對于自然醬醪pH下發酵的醬油滋味更加濃郁。