混合菌株發酵白菊薄荷紅茶調味醋的研制

賀羽，李慧，王帥*

(1.徐州工程學院 食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221018；2.徐州工程學院江蘇省 食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018)

發酵調味醋在我國古代秦朝的時候就已經產生，始終廣泛盛行于東南亞地區、日韓和歐洲中東部各個國家，發酵過程中會產生對人體健康有益的多種物質[1]。經常飲用，可以達到保健、預防疾病、延長壽命和美容護膚的作用，因此發酵調味醋一直具有“養生飲料”、“保健醋品”等美譽[2]。黃山貢菊在安徽省黃山市的廣大區域產量豐富，藥用保健功能比較豐富，有清熱瀉火、祛除體內風邪、平膽明目、清冷解毒等效用，長時間飲用能防止中暑、祛除胸中煩悶、清凈五臟、排除身體內毒素、提神明目、延年益壽，對多種疾病也可以起到預防的作用[3]。菊花中包含的黃酮類化合物對某些心血管疾病和腦血管系統有良好的治療效果，還具有預防和治療高血壓和動脈硬化，以及降低血壓和膽固醇的功效，還可以使冠狀動脈擴張和防止血栓形成[4]。 薄荷在中國是常用的中藥之一，對流行性感冒、頭疼、目赤、身熱、咽喉痛、牙齦腫痛等癥有很好的治療作用。紅茶是一種以綠茶為基礎的經發酵而制成的茶葉，在中國是6種茶中最有影響的茶種，同時中國也是世界上最早生產和以紅茶為飲品的國家[5]。相關研究表明，紅茶中的生物活性物質兒茶素和茶黃素也對人體的疾病起到防治的作用，可降低人體血漿內尿酸和其中C-反應蛋白量[6,7]，降低血糖濃度、甘油三脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量比例，同時增加血漿中的抗氧化劑，有利于使患心血管疾病的風險得以降低[8]。與此同時，紅茶也具有防癌、抗腫瘤、預防慢性炎癥、降低肥胖率、預防神經性疾病的功能[9]。

盡管發酵茶菌調味醋在中國有著悠久的歷史，但它仍處于一個小范圍內，是初級階段的獨立生產與消費。這種家庭文化，培養出來的發酵茶調味醋很容易被細菌污染，而且溫度不容易控制，由于菌種容易退化，對大規模生產造成困難。目前，主要專注研究發酵菌株的菌種分離、代謝產物的鑒定以及菌種的抗菌性能等方面，最近幾年，陸續發表了許多有關復合乳酸菌菌株研究的文章，但對其發酵的茶調味醋的研究所知甚少[10]。本實驗主要研究在37 ℃培養箱條件下，不同單因素條件對復合發酵茶調味醋加工的影響。具體的研究內容包括：紅茶的用量對調味醋的影響；黃山貢菊的用量對調味醋的影響；薄荷的用量對調味醋的影響；白砂糖的用量對調味醋的影響；混合菌株的接種量對調味醋的影響。從而通過響應曲面的方法確定一套合理的加工工藝。同時參考調味醋的口感、風味、色度、pH等指標完善配方，以確定此款發酵茶調味醋的風味和營養價值達到最佳時的原料配比，為進一步豐富復合發酵茶調味醋的種類、規模化生產建立一定的基礎參考。

1 原料與設備

1.1 實驗材料與試劑

實驗用紅茶：購自徐州大潤發超市；黃山貢菊、薄荷葉：購自雅盛旗艦店；白砂糖：購自廣州福正東海食品有限公司。發酵所用嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusKP15、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusKP36和植物乳桿菌LactobacillusplantarumKP59為本課題組篩選保藏菌株，已經過毒理及益生檢測。

1.2 主要儀器與設備

JA2104N型電子天平、電熱恒溫干燥機、臺式低速離心機、色差儀、720 nm分光光度計、pH計、電磁爐、HPX-9052MBE電熱恒溫培育箱、存儲罐、超凈工作臺。

2 實驗方法

2.1 發酵方法

以紅茶、黃山貢菊、薄荷葉和白砂糖為原料，再以一定的比例倒進水壺，加入1 L蒸餾水，煮沸后保持50 min，然后冷卻，使用8層紗布進行過濾，再加入蒸餾水定容到原來體積，混勻。再經過121 ℃高溫滅菌20 min，使之冷卻到室溫，再倒入標有刻度的發酵罐中，平均每罐150 mL，根據課題組的益生特性實驗，L.acidophilusKP15、L.rhamnosusKP36和L.plantarumKP59添加比例為1∶2∶3，混合活化后，將10%的混合菌種發酵液接入發酵罐中，37 ℃厭氧發酵48 h，制得發酵茶飲。工藝流程如下：

2.2 感官評定指標

感官評分：隨機尋找30名具有專業水平的感官評定員組成感官評定小組對白菊薄荷紅茶發酵調味醋進行感官評定，打出分數。感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 The sensory evaluation standard

評定員按照表1中的各項指標給該醋飲打分，并記錄下來，最終計算出感官評定的總分。通過對調味醋感官總分的分數高低結合各項指標得分來評價產品風味的優劣。

2.3 色差儀測定醋飲色度

測定方法：采用WF32-8MM色差儀測定各種原料比例制作而成的發酵調味醋的色差 L值、a值、b值，取平均值。目前最常用的表示顏色的方法是L、a、b顏色空間法，L值表示樣品顏色的亮度，L值越大，樣品越澄清透明；a值表示紅綠色方向，a值為正值表示樣品紅色方向的程度值，a值為負值表示樣品綠色方向的程度值；b值表示黃藍色方向，b值為正值表示樣品黃色方向的程度值，b為負值表示樣品藍色方向的程度值。L值、a值、b值是紅茶調味醋外觀評定的一項指標，不但能用來測量發酵調味醋的亮度，更能對醋飲的色澤等給予客觀的量化評價[11]。

2.4 pH計測定發酵醋飲的酸度

白菊薄荷紅茶發酵調味醋pH值的測定：用蒸餾水沖洗電極3～5次，用濾紙吸干，然后將電極放入樣品中，待pH 值穩定后讀數，每個樣品重復測定3次，記錄數據。測定完畢后，將電極清洗干凈，把電極浸泡在蒸餾水中，將樣品的pH值記錄成表。

2.5 苯酚-硫酸法測定總糖含量(以葡萄糖計)[12]

2.5.1 標準曲線的制備

準確稱取標準葡萄糖62.5 mg于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。然后分別移取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 mL到5支100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。再取出5個試管，用移液槍準確移取上述溶液各1.0 mL分別放入試管中，再分別加入5.0 mL濃硫酸和2.0 mL 50 g/L的苯酚溶液，用蒸餾水定容，在室溫下放置顯色40 min后于490 nm處測定吸光度，另以1.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白。以測量出的吸光度值Y為縱坐標，葡萄糖的毫克數X為橫坐標作圖，能夠得到標準曲線。

2.5.2 發酵醋飲樣品的測定

取50 mL干燥離心管，稱取空管質量。準確稱取發酵茶培養液5 mL，加入無水乙醇至終體積的90%，經離心機離心15 min，倒掉上清液，烘干，稱離心管及沉淀質量，計算粗多糖質量。然后用移液槍準確移取50 mL蒸餾水將其復溶，準確移取10 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，再次定容。移取上述溶液1.0 mL于10 mL試管中，使用和制作標準曲線相同的實驗方法，測定吸光度，重復3次，代入葡萄糖標準曲線回歸方程，通過計算得到多糖含量的平均值(以葡萄糖計)，從而計算糖利用率。

3 結果與分析

3.1 白菊薄荷紅茶發酵醋飲的感官實驗評定

用紅茶使用量、黃山貢菊使用量、薄荷使用量、混合菌株發酵液使用量、白砂糖使用量做單因素實驗，從而分析5個因素對白菊薄荷紅茶發酵調味醋風味的影響。感官評分結果見表2～表6。

表2 紅茶用量對感官品質的影響Table 2 The effect of black tea additive amount on sensory quality

表3 白菊用量對感官品質的影響Table 3 The effect of white chrysanthemum additive amount on sensory quality

表4 薄荷用量對感官品質的影響Table 4 The effect of mint additive amount on sensory quality

表5 白砂糖用量對感官品質的影響Table 5 The effect of sugar additive amount on sensory quality

表6 混合菌株接種量對感官品質的影響Table 6 The effect of mixed-strains inoculation amount on sensory quality

續 表

通過對上述感官評分進行分析，可繪制紅茶用量、白菊用量、薄荷用量、白砂糖用量、混合菌種發酵液接種量對白菊薄荷紅茶調味醋感官評分的影響曲線，見圖1。

圖1 各因素對發酵調味醋感官品質的影響Fig.1 The effect of each factor on sensory quality of fermented seasoning vinegar

注：A為紅茶用量對感官品質的影響；B為白菊用量對感官品質的影響；C為薄荷用量對感官品質的影響；D為白砂糖用量對感官品質的影響；E為復合菌種發酵液接種量對感官品質的影響。

由圖1可知，白菊薄荷紅茶調味醋的紅茶用量在5～8 g/L之間品質較好，各項指標及總分較高，白菊用量在6～10 g/L時風味怡人，薄荷用量在2～6 g/L、白砂糖用量在40～60 g/L、混合菌菌液接種量在5%～15%之間時口味達到最好。綜上所述，白菊薄荷紅茶發酵調味醋達到風味最佳的配方范圍為：紅茶用量在5～8 g/L，白菊用量在6～10 g/L，薄荷用量在2～6 g/L，白砂糖用量在40～60 g/L，菌液接種量在5%～15%。

3.2 色差儀測定醋飲色度

用WF32-8MM色差儀測定各成品發酵調味醋的L值、a值、b值，測定3次，取平均值，記錄數據，見表7～表12。

表7 紅茶加入量對色澤的影響Table 7 The effect of black tea additive amount on color

由表7可知，在其他發酵條件不變的情況下，發酵調味醋的L值隨著紅茶加入量的增加先上升再下降而后再上升，在紅茶用量為6 g/L時，L值最大，為16.76； a值隨著紅茶加入量的增加逐漸下降，最后趨于平穩；b值隨著紅茶用量的增加先上升后下降再上升。所以，紅茶用量為6 g/L時，發酵調味醋澄清透明，顏色為橙黃色，色澤明亮，感官效果極好。

表8 白菊加入量對色澤的影響Table 8 The effect of white chrysanthemum additive amount on color

續 表

由表8可知，在其他發酵條件不變的情況下，發酵調味醋的L值隨著白菊加入量的增加而上升，總體比較穩定，L值在15左右；a值隨著白菊加入量的增加先上升后下降；b值隨著白菊用量的增加先上升后下降。所以，當白菊用量為8 g/L時，發酵調味醋澄清透明，顏色為橙黃色，色澤明亮，感官效果極好。

表9 薄荷加入量對色澤的影響Table 9 The effect of mint additive amount on color

由表9可知，在其他發酵條件不變的情況下，發酵調味醋的L值隨著薄荷加入量的增加先下降后上升，當薄荷用量為2 g/L 或8 g/L時，L值在15左右；a值隨著薄荷加入量的增加先下降后上升；b值隨著薄荷用量的增加先上升后下降。所以，當薄荷用量為2 g/L或8 g/L時，發酵調味醋澄清透明，顏色為橙黃色，色澤明亮，感官效果極好。

表10 白砂糖加入量對色澤的影響Table 10 The effect of sugar additive amount on color

由表10可知，在其他發酵條件不變的情況下，發酵調味醋的L值隨著白砂糖加入量的增加而上升，當白砂糖用量為50 g/L或超過50 g/L時，L值在14左右；a值隨著白砂糖加入量的增加逐漸下降；b值隨著白砂糖用量的增加先下降后上升。所以，當白砂糖用量為50～70 g/L之間時，發酵調味醋澄清透明，顏色為橙黃色，色澤明亮，感官效果極好。

由表11可知，在其他發酵條件不變的情況下，發酵調味醋的L值隨著菌液接種量的增加呈逐漸下降趨勢，但除了菌液接種量為20%時，其他條件下L值都較高；a值隨著菌液接種量的增加呈下降趨勢；b值隨著菌液接種量的增加也呈下降趨勢。所以，當菌液接種量為5%～15%之間時，發酵調味醋澄清透明，顏色為橙黃色，色澤明亮，感官效果極好。

3.3 醋飲有效酸度的測定結果

利用pH計測定白菊薄荷紅茶發酵調味醋的有效酸度，實驗結果見表12。

表12 醋飲樣品的標準酸度Table 12 The standard acidity of vinegar sample

在食品檢測中，測量發酵調味醋的有效酸度對描述該醋飲的品質具有重要意義。有關研究顯示，市場上的維他命水、果珍、茉莉花茶的有效酸度大多分別為3.27，3.39，5.85[13]。由表12可知，白菊薄荷紅茶發酵調味醋的有效酸度范圍在2.90～4.78，由此可見，該發酵調味醋風味甚佳，受廣大消費者喜愛。

3.4 單因素實驗總糖含量測定分析

3.4.1 葡萄糖標準曲線的制備

根據苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線，見圖2。

以測定的標準葡萄糖溶液的吸光度值Y為縱坐標，葡萄糖的毫克數X為橫坐標作圖，可得標準曲線圖(見圖2)。然后對實驗數據進行回歸分析，可以得到葡萄糖標準溶液的回歸方程為Y=1.032X-0.0044，R2=0.9989，表示葡萄糖質量在0.025～0.125 mg之間有良好的線性關系。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 The standard curve of glucose

3.4.2 加入量對發酵效果的影響

紅茶的加入量分別為4，6，8，10 g/L，復合菌種發酵液接種量為10%，貢菊加入量為6 g/L，薄荷葉加入量為4 g/L，白砂糖加入量為50 g/L，于37 ℃發酵4 d；在其他制作條件及原料加入量一定時，總糖利用率隨著紅茶加入量的增加先上升后下降，在紅茶加入量為6 g/L時總糖利用率最高，綜上，要使總糖利用率最高，紅茶加入量應為6 g/L。貢菊的加入量分別為6，8，10，12 g/L，紅茶加入量為6 g/L，復合菌種發酵液接種量為10%，薄荷加入量為4 g/L，白砂糖加入量為50 g/L， 于37 ℃發酵4 d；在其他制作條件及原料加入量一定時，總糖利用率隨著貢菊加入量的增加先上升再下降又緩慢上升，在貢菊加入量為8 g/L 時總糖利用率最高，綜上，要使總糖利用率最高，貢菊加入量應為8 g/L。薄荷的加入量分別為2，4，6，8 g/L，紅茶加入量為6 g/L，貢菊加入量為6 g/L，復合菌種發酵液接種量為10%，白砂糖加入量為50 g/L，于37 ℃發酵4 d；在其他制作條件及原料加入量一定時，總糖利用率隨著薄荷加入量的增加先下降再上升，在薄荷加入量為8 g/L 時總糖利用率最高，綜上，要使總糖利用率最高，薄荷加入量應為8 g/L。白砂糖的加入量分別為40，50，60，70 g/L，紅茶加入量為6 g/L，貢菊加入量為6 g/L，薄荷加入量為4 g/L，復合菌種發酵液接種量為10%，于37 ℃發酵4 d；在其他制作條件及原料加入量一定時，總糖利用率隨著白砂糖加入量的增加先上升再下降，在白砂糖加入量為50 g/L時總糖利用率最高，綜上，要使總糖利用率最高，白砂糖的加入量應為50 g/L。復合菌株發酵液接種量分別為5%、10%、15%、20%，紅茶加入量為6 g/L，貢菊加入量為6 g/L，薄荷加入量為4 g/L，白砂糖加入量為50 g/L，于37 ℃發酵4 d；在其他制作條件及原料加入量一定時，總糖利用率隨著復合菌株發酵液接種量的增加先上升再下降，在菌液接種量為10%時總糖利用率最高，綜上，要使總糖利用率最高，菌液接種量應為10%，實驗結果見圖3。

圖3 各因素加入量對糖的利用率Fig.3 The utilization rate of each factor additive amount on sugar

注：A為紅茶用量對糖利用率的影響；B為白菊用量對糖利用率的影響；C為薄荷用量對糖利用率的影響；D為白砂糖用量對糖利用率的影響；E為復合菌種發酵液接種量對糖利用率的影響。

3.5 Box-Benhnken實驗設計

3.5.1 白菊薄荷紅茶發酵茶醋飲糖利用率統計

根據單因素實驗結果，利用 Box-Benhnken實驗設計，以總糖的利用率為響應值，綜合單因素實驗結果，考察復合菌種發酵液接種量、白糖加入量、白菊加入量3個因素的相互作用，并進行響應面分析，對發酵工藝條件進行優化。取之前單因素最優點兩側的數值得到三因素三水平，通過軟件分析得到所需要的17組數據，分別進行實驗，見表13。

表13 產品響應指標結果Table 13 The results of product response indexes

3.5.2 方差分析及響應面法分析

利用方差分析法對實驗數據進行分析，結果見表14。利用軟件 Design-Expert 8.0.6對結果進行分析，得到糖利用率與復合菌種發酵液接種量、白菊加入量與白糖加入量間的擬合回歸模型：

糖利用率=+82.05-0.11A-0.44B+0.54C-0.41AB+0.14AC-0.015BC-1.44A2-2.05B2-1.17C2。

式中：A為復合菌種發酵液接種量；B為白糖加入量；C為薄荷加入量。

表14 方差分析表Table 14 The analysis of variance table

由表14可知，總回歸的F值為5.84， p值為0.0149(0.01

圖4 復合菌種發酵液接種量與白糖加入量 響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.4 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of inoculation amount of mixed-strains fermentation liquid and additive amount of sugar

由圖4可知， 當菌液接種量在9.0%時，糖利用率隨著白糖加入量的增加先上升后下降。當接種量在10.0%左右時，糖利用率隨著白糖加入量的增加先增加，在白糖加入量為50.0 g/L左右時達到一個峰值，然后下降。當白糖加入量為45.0 g/L時，糖利用率隨著菌液接種量的增加先上升后下降。當白糖加入量在50.0 g/L左右時，糖利用率隨著菌液接種量的增加先增加，在接種量為10.0%左右時達到峰值，然后下降。

圖5 復合菌種發酵液接種量與薄荷加入量 響應曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.5 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of inoculation amount of mixed-strains fermentation liquid and additive amount of mint

由圖5可知，當菌液接種量為9.0%時，糖利用率隨著薄荷加入量的增加緩慢增長，趨勢不明顯，影響不大。當菌液接種量為10.0%左右時，糖利用率隨著薄荷加入量的增加先上升，在薄荷加入量為8.0 g/L左右時達到一個峰值，然后下降。當薄荷加入量為7.0 g/L時，糖利用率隨著復合菌種發酵液接種量的增加先緩慢上升再緩慢下降。當薄荷加入量為8.0 g/L左右時，糖利用率隨著菌液接種量的增加先上升，在菌液接種量為10.0%左右時達到峰值，然后下降。

圖6 白糖加入量與薄荷加入量響應曲面圖(A) 與等高線圖(B)Fig.6 Response surface diagram (A) and contour diagram (B) of additive amount of sugar and mint

由圖6可知，當白砂糖加入量為45.0 g/L時，糖利用率隨著薄荷加入量的增加先上升后下降。當白砂糖加入量在50.0 g/L左右時，糖利用率隨著薄荷加入量的增加先增加，在白糖加入量為50.0 g/L左右時達到峰值，然后下降。當薄荷加入量為7.0 g/L時，糖利用率隨著白砂糖加入量的增加先緩慢上升再緩慢下降。當薄荷加入量為8.0 g/L左右時，糖利用率隨著白砂糖加入量的增加先上升，在白砂糖加入量為50.0 g/L左右時達到峰值，然后下降。

所以，經過 Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到，在復合菌種發酵液接種量為9.99%、白砂糖加入量為49.89 g/L、薄荷加入量為8.23 g/L時，糖利用率達到最高，為82.134%。

3.6 驗證實驗

通過對響應曲面得到的最佳方案為：復合菌種發酵液接種量9.99%，白砂糖加入量49.89 g/L，薄荷加入量8.23 g/L，根據所得數據，做一組驗證實驗，見表15。

表15 數據分析后最佳方案的糖利用率Table 15 The sugar utilization rate of optimal scheme after data analysis

由表15可知，糖利用率最高為82.134%，實際驗證實驗所得糖利用率最高為79.65%，兩者相差不大。因此，結合感官評定及有效酸度確定調味醋的最佳條件為菌液接種量10.0%，白糖加入量50.0 g/L，薄荷加入量8.2 g/L，紅茶加入量6 g/L，白菊加入量8 g/L。

4 討論

本實驗采用單因素法和響應面法優化復合菌種發酵液的發酵工藝，結合總糖利用率(以葡萄糖計)得到最佳工藝條件。結果表明，白菊薄荷紅茶發酵調味醋的最佳配方為每1 L醋飲中，紅茶用量為6 g，白菊用量為8 g，薄荷用量為8.2 g，白砂糖用量為50 g，復合菌種發酵液接種量為10%。在此工藝條件下，在37 ℃的環境中發酵4 d，白菊薄荷紅茶發酵調味醋的口感良好，色澤和氣味比較受人喜愛，并且此時醋飲中的總糖利用率最高，營養價值也處于最佳階段，比普通的紅茶醋飲略勝一籌。因為其出色的口感、良好的色澤與怡人的香氣，再加上特有的保健功能，對于現在快節奏生活的年輕消費者和大部分老年消費者來說，不愧是最佳的選擇。與此同時，通過感官評定、pH的測定等方法，對發酵調味醋的口感、風味具有一定的參考和改善，可以使發酵調味醋在具備最佳保健功能的同時，不失其風味與色澤，使其成為一種風味獨特、營養健康的復合發酵調味醋，適合男女老少日常保健飲用。這幾者相結合，制成風味獨特的復合型發酵醋飲品，用普通的食材，使廣大普通人群享受到很好的保健方式。未來，像貢菊、薄荷這樣日常飲用的茶品，經過專業的工藝條件，與紅茶發酵而成的獨特的功能性調味醋將成為普通家庭的日常必備，既豐富了調味品的口感、風味，又滿足了飲用人群對飲料保健功能的需求。像發酵調味醋這樣的許多民間傳統文化，我們需要去發現并使它們發揚光大。隨著社會的發展、人民生活水平的提高以及對養生的重視，這類產品將會更受青睞。