BRAFV600E基因突變與甲狀腺微小乳頭狀癌臨床病理特征的相關性

禹 樂,朱啟淦,溫路生,魁國菊,楊立民,孟加榕,陳淑敏

(1聯勤保障部隊第909醫院,廈門大學附屬東南醫院病理科,漳州 363000;2漳州衛生職業學院病理學教研室;*通訊作者,E-mail:1274801787@qq.com)

甲狀腺癌是內分泌系統最為常見的一類惡性腫瘤,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是其最常見的病理類型,約占80%-90%。近年來隨著高頻彩超的廣泛應用,腫塊直徑≤10 mm的甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)檢出率呈明顯的增長趨勢[1]。以往認為PTMC的生物學行為較溫和,死亡率較低,但早期仍可見淋巴結轉移,使初次手術的方式和術后的治療存在爭議。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因突變是甲狀腺癌中最常見的遺傳學事件,BRAFV600E基因突變與PTC的高侵襲性密切相關[2,3],但對于原發灶很小的PTMC的報道相對較少。本研究旨在探討BRAFV600E基因突變情況與PTMC臨床病理特征的相關性,為PTMC患者的臨床管理和預后提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2012-01～2018-12期間在聯勤保障部隊第909醫院收治的臨床資料完整的PTMC手術患者作為研究對象,所有患者均符合無甲狀腺病史和甲狀腺相關藥物服用史,接受患側甲狀腺葉全切、峽部切除或全甲狀腺切除術,并行預防性患側中央區淋巴結清掃;所選病例的術后標本均由兩名高年資病理醫生診斷,疑難病例由多名病理診斷醫生共同討論后診斷,最終收集符合標準病例共173例?；颊叩哪[瘤分期采用美國癌癥聯合會(AJCC)2017年第8版本的TNM分期標準。

1.2 主要試劑和儀器

石蠟切片(FFPE)核酸提取試劑盒、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(熒光PCR)均購于廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司,主要儀器是美國ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.3 DNA提取與檢測

取7-8 μm厚的石蠟切片1-5片至1.5 ml離心管中,組織樣本的DNA提取按照石蠟切片核酸提取試劑盒提供的說明書進行操作,應用紫外分光光度計對提取DNA的樣本的濃度與質量,濃度大于2 ng/μl,OD260/OD280比值范圍在1.6-2.2之間,OD260/OD230比值大于1.6為合格DNA樣本。

1.4 檢測原理

本實驗所用試劑盒是基于突變擴增阻滯系統(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)和熒光PCR技術來實現樣本DNA中BRAFV600E基因突變的檢測。其原理是針對BRAFV600E基因突變位點設計特異的突變檢測引物,在PCR擴增時,由于該引物3′末端的堿基與突變型模板完全配對,引物延伸并擴增出突變模板,而與野生型模板由于不能完全配對,引物的延伸被阻斷,野生型模板擴增被抑制,擴增的同時利用FAM標記的雙環探針熒光探針對擴增產物進行實時檢測,從而實現BRAFV600E基因突變的檢測。

1.5 檢測主要步驟

取出檢測試劑置于室溫中平衡10 min,待其完全融化后短暫離心,并置于冰盒上,取35 μl反應混合液加入到PCR反應管中,依次加入0.4 μl Taq酶、5 μl稀釋為2 ng/μl的待檢DNA樣品,用同樣的方法建立陰性、陽性對照,離心PCR反應管,使所加的試劑聚集到反應管的底部,最后將PCR反應管置于ABI7500實時熒光定量PCR儀中反應;循環條件為95 ℃ 5 min,1個循環;95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環;93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,31個循環;收集信號,觀察曲線,對檢測結果進行判讀。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 臨床病理特征

本研究173例PTMC患者中,男性17例(9.8%),女性156例(90.2%),年齡在17-71歲之間,平均(44.5±10.1)歲,其中≥45歲的93例(53.8%),<45歲的80例(46.2%);腫瘤直徑為0.15-1.0 cm,平均直徑為(0.65±0.21)cm,其中腫瘤直徑0.5-1.0 cm為119例(68.8%),腫瘤直徑<0.5 cm的54例(31.2%);腫瘤出現腺外侵犯7例(4.0%),未出現腫瘤腺外侵犯166例(96.0%);發生淋巴結轉移48例(27.7%),未出現淋巴結轉移125例(72.3%);腫瘤分期為T1期166例(96.0%),T3期為7例(4.0%)。

2.2 BRAFV600E基因突變在PTMC中的突變情況

173例PTMC患者樣本中發生BRAFV600E基因突變為104例,突變率為60.12%;野生型為69例(檢測擴增曲線見圖1)。

A.突變型樣本擴增曲線 B.野生型樣本擴增曲線圖1 BRAFV600E基因突變檢測擴增曲線Figure 1 Amplification curve of BRAFV600E gene mutation detection

2.3 BRAFV600E基因突變與PTMC臨床病理特征的相關性

統計本組研究結果顯示:BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關性(P>0.05);與患者的腫瘤直徑大小、淋巴結轉移呈正相關(均P<0.05,見表1)。

表1 BRAFV600E基因突變與PTMC患者臨床病理特征的關系(例)

Table 1 Relationship between BRAFV600Egene mutation and clinicopathological characteristics of PTMC patients(cases)

臨床病理特征項目nBRAFV600E基因突變型野生型χ2P性別0.16570.6840 男17116 女1569363年齡0.00080.9770 <45歲804832 ≥45歲935637腫瘤直徑4.6890.0304 0.5-1 cm1197841 <0.5 cm542628病灶數2.30800.1287 單發1629567 多發1192鈣化0.000030.9957 是532 否16810167腺外侵及0.38940.5326 是752 否1669967淋巴結轉移31.34<0.0001 是48453 否1255966腫瘤T分期0.38940.5326 T11669967 T3752

3 討論

BRAF基因屬于RAF家族成員,位于人染色體的7q34,含有18個外顯子,編碼蛋白質的相對分子質量約為94 kD,包含783個氨基酸殘基,屬于絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶,是一種高效的磷酸化劑,是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號傳導通路最為關鍵的激活因子,參與調控細胞內多種生物學事件,如細胞生長、分化和凋亡等[4]。BRAF基因最常見的突變是發生在15外顯子上第1 799位核苷酸胸腺嘧啶轉化為腺嘌呤(T1799A),引起BRAF蛋白第600位密碼子的纈氨酸被谷氨酸替代,從而導致BRAF激酶激活向MAPK信號通路下游持續傳遞有絲分裂信號,造成細胞過度增殖、分化及腫瘤的形成和持續生長[5]。近幾年隨著對PTC的分子發病機制研究發現,BRAFV600E基因突變是其最常見的基因變化,目前認為BRAFV600E基因突變與PTC的發生、發展密切相關,已成為了解PTC患者預后一種重要途徑。

近年來隨著高頻彩超的廣泛應用,PTMC的檢出率呈明顯的增長趨勢,2014年WHO公布的全球癌癥報告指出,甲狀腺癌新發病例中PTMC已經超過50%,雖然大多數PTMC腫瘤的生物學行為傾向于良性,處于低危狀態,預后良好,但是部分PTMC具有高侵襲性的臨床病理特點,可出現原發灶很小就有淋巴結轉移,甚至全身多發轉移[6]。目前對于PTMC風險評估的關鍵指標包括高齡、男性、較大腫瘤直徑、腺外侵及、局部淋巴結轉移、遠處轉移和高級別的病理分期,但這些大多是以術后病理學檢查結果和回顧性研究為主,對術前評估及術中指導價值有限。現階段PTMC的治療方式主要是手術,預防性中央區淋巴結清掃術(central lymph node dissection CLND)作為最常用的手術方式,預防性CLND雖然可清掃亞臨床轉移病灶,但同時也擴大了手術范圍,增加了甲狀旁腺喉返神經損傷和出血的風險,臨床上對于淋巴結轉移陰性的PTMC患者手術治療時是否同期行預防性CLND仍存在較大爭議,如何進行中央區淋巴結轉移的術前風險評估成為臨床急需解決的問題。

現有研究結果顯示[7-10],在PTC患者中BRAFV600E突變型比野生型的復發率更高,BRAFV600E突變與腫瘤侵襲性特征呈正相關,BRAFV600E基因突變可以用于評估PCT的危險程度,在PTC患者中BRAFV600E基因突變率約為29%-88%,而在PTMC患者中BRAFV600E基因突變率則略低一些,約為15%-65.1%,本研究173例PTMC患者中發生BRAFV600E基因突變的為104例,突變率為61.12%,與現有報告數據較一致。多數研究表明BRAFV600E基因突變與PTC患者的腫瘤大小、腺外侵犯、淋巴結轉移及腫瘤疾病分期等多項臨床病理特征相關[11,12],而目前關于BRAFV600E基因突變與PTMC患者的臨床病理學特征之間關系的相關報道還是相對較少,得出的結論也不盡相同,甚至有部分報道在某些結論上仍存在較大的爭議,尚未達成統一。本研究結果顯示BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關性(均P>0.05),這些差別可能與研究對象納入標準、樣本例數、統計標準等各種因素有關。

Liu等[13]認為腫瘤直徑≥0.5 cm時,BRAFV600E基因突變率和淋巴結轉移的發生率更高,對于發生淋巴結轉移的PTMC患者BRAFV600E突變是獨立的危險因素,但腫瘤直徑≤5 mm者未見明確相關性。在本組研究中,腫瘤直徑>0.5 cm組BRAFV600E突變率為65.5%,明顯高于≤0.5 cm組的48.1%,差異有統計學意義(P<0.05),顯示腫瘤直徑越大其BRAFV600E基因突變率越高;在發生淋巴結轉移的48例患者中出現BRAFV600E突變的為45例,突變率高達93.8%,而在無淋巴結轉移的125例患者中,BRAFV600E基因發生突變的為59例,突變率為47.2%,發生淋巴結轉移患者的BRAFV600E基因突變率明顯高于未突變者,差異有統計學意義(P<0.05),表明發生BRAFV600E突變的腫瘤細胞可能更具有侵襲性,更容易從原發灶轉移到淋巴結或其他地方,BRAFV600E突變可能是導致PTMC早期發生淋巴結轉移一大重要因素。Zheng等[14]和Czarniecka等[15]的報道在得到了相似結論的同時,進一步提出了BRAFV600E突變可以當做PTMC患者淋巴結發生轉移的獨立危險因素的觀點。Lang等[16]和Lee等[17]學者認為術前分析BRAFV600E基因突變情況可為不必要的預防性CLND提供依據,BRAFV600E基因存在突變的患者則建議執行預防性中央區淋巴結清掃術。

綜上所述,本研究結果顯示BRAFV600E基因突變與PTMC患者的性別、年齡、多發病灶、甲狀腺腺外侵及、是否伴隨鈣化、腫瘤分期等臨床病理特征均無相關性,與腫瘤大小和淋巴結轉移呈正相關,BRAFV600E基因突變與PTMC侵襲性的生物學行為有一定的相關性,可為術前手術選擇和預后提供一定的參考價值。但BRAFV600E基因突變能否作為PTMC淋巴結轉移風險與復發的獨立預測因子仍需進一步深入研究。