miR-141-3p靶向調控DLC1對前列腺癌骨轉移的作用

葉 蕓,李蘇亮,郝曉柯

(1西安醫學院第一附屬醫院輸血科,西安 710077;2空軍軍醫大學西京醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:haoxkg@fmmu.edu.cn)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿系統較常見的惡性腫瘤之一,發病率在歐美人群中居首位,死亡率僅次于肺癌[1]。隨著我國人口老齡化及飲食結構的改變,前列腺癌的發病率逐漸增加。miRNA是一類19-24 nt左右的非編碼RNA,可與靶mRNA3′UTR結合并調控基因表達,導致靶基因異常[2,3]。miRNA的異常表達與腫瘤的發生發展存在關聯[4],有關循環miRNA和前列腺癌之間關系的研究已經有很多報道,包括多種miRNAs如375、34a、141、let-7a等[5,6]。Bryant等[7]和Selth等[8]分別通過臨床試驗和動物實驗證實轉移性PCa與miR-141水平相關,轉移性PCa的miR-141水平高于未轉移者。然而,關于miR-141對于前列腺癌骨轉移發生發展的作用及確切調控機制等問題尚需進一步研究明確。本文旨在探討miR-141-3p與DLC1在調控前列腺癌骨轉移發生發展過程中的作用,為前列腺癌骨轉移的診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 ①細胞株:人前列腺癌細胞MDA PCa 2b和人前列腺上皮細胞RWPE-1購自美國模式菌種收集中心ATCC(Manassas, VA, USA)。②實驗動物:6周齡Balb/c裸鼠購自空軍軍醫大學動物實驗中心。③血清樣本:收集2013-01～2018-08于我院病理確診的前列腺癌骨轉移患者,局限性前列腺癌患者及年齡匹配的門診體檢健康男性血清樣本(清晨空腹靜脈血3 ml),每組各20例。本研究已通過西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核(批號:XYFY-0131)。

1.1.2 主要試劑與儀器 F12K細胞培養基(Gibco BRL Co. Ltd.,USA);青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml(HyClone,Logan,UT,USA);胎牛血清(Gibco BRL Co.Ltd.,USA);mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion公司);M-MLV逆轉錄試劑盒(Takara公司);Trizol試劑盒(Invitrogen公司);TRAP染色試劑盒(Sigma公司);ALP染色試劑盒(Solarbio公司);HE染色試劑盒及Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司);鼠抗兔多克隆DLC1抗體、鼠抗兔多克隆Cdc42抗體、鼠抗兔多克隆p38抗體、鼠抗兔多克隆OPG抗體(Abcam公司);賽默飛世爾CO2培養箱(Thermo Fisher公司);美國ABI 7500 PCR儀(美國ABI公司);Siemens Inveon Micro-CT(德國Siemens公司);小動物氣體麻醉機(美國harvard公司);RM2245石蠟切片機(德國Leica公司);Illumina HiSeqTM 2500測序儀(Illumina公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MDA PCa 2b和RWPE-1細胞使用含有L-谷氨酰胺的F12K細胞培養基,10%胎牛血清的細胞培養基中,置于37 ℃ 5%CO2環境的培養箱中。

1.2.2 miR-141-3p與DLC1之間靶向關系預測 應用miRGator 3.0軟件及TargetScan Human 7.1,對miR-141-3p與DLC1之間靶向關系進行預測。

1.2.3 樣本中總RNA的提取及real-time PCR Trizol法提取細胞中RNA,檢測RNA純度。根據反轉錄試劑盒(Takara)操作說明進行逆轉錄,將所得的cDNA加入75 μl ddH2O稀釋用作real-time PCR模板,real-time PCR的程序設置:94 ℃進行預變性2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min,共40個循環。在ABI 7500(Applied Biosystems)PCR儀上進行操作,使用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量,qRT-PCR引物購自上海生工生物科技有限公司,引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

基因序列 DLC1F:TGGACAACGACCGAACCACADLC1R:CCATCTCAGTCGGTGCCTGTGAPDHF:GGGTGTGAACCATGAGAAGTGAPDHR:GACTGTGGTCATGAGTCCTmiR-141-3pRT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCCATCTTTmiR-141-3pF:ATGGTTCGTGCGTAACACTGTCTGGTAAAU6 HoMsRnF:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6 HoMsRnR:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT通用HoMsRnR:GCAGGGTCCGAGGTATTC

1.2.4 構建cDNA文庫 凝膠電泳進行miRNA分離純化,然后逆轉錄進行cDNA的合成,分別在3′端與5′端進行接頭連接,最后PCR擴增,獲取miRNA的測序文庫。根據Illumina Hi SeqTM 2500測序儀的標準進行操作,將cDNA文庫上機測試。該部分實驗是由廣州銳博生物公司檢測完成。

1.2.5 生物信息學分析 通過對樣本進行測序所得50 nt原始序列集(raw reads)初步過濾,獲得干凈序列(clean reads),統計計算序列長度的分布和樣本的共有序列。將clean reads進行分類和注釋,得到樣品中各種sRNA(小分子RNA)的成分和表達信息。去除miRNA外的非編碼RNA的序列后,和miRBase 21.0數據庫已知人類的miRNA序列進行了比較。當所有的小RNA片段均被注釋后,用校正公式進行miRNA表達值的計算。使用散點圖和log2Ratio進行比較共表達miRNA的表達量。| log2(Fold Change)|=log2(樣品2 RPM值/樣品1 RPM值)絕對值。利用edger分析對每個組中miRNA差異的顯著性進行分析并計算P值,以此為基礎計算-log10P值并篩選差異表達的miRNA。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 采用PCR的方法,按照DLC1(human) 3′UTR的序列信息來設計擴增引物,293T基因組DNA作為模板擴增其DLC1 3′ UTR的序列并克隆至pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶的報告載體之中,載體報告熒光是hRluc,校正熒光是hluc。以野生型載體為基礎,利用PCR的方法設計突變引物構建突變載體,將靶序列CAGTGTTA突變成為GTCACAAT(mut1),CAGTGTT突變成為GTCACAA(mut2)。37 ℃ 5% CO2的常規條件下培養293T細胞,將293T細胞1.5×104/孔的濃度接種至96孔板,每孔的體積為100 μl,37 ℃培養24 h。按照LipofectamineTM2000轉染步驟將野生型及突變型報告質粒分別與mimics(內源性成熟miRNA功能活性增強劑)及mimics NC(陰性對照)共轉,轉染結束后,使用熒光照度計進行熒光值的測定。

1.2.7 轉染實驗 miR-141-3p mimics,陰性對照寡核苷酸(miR-NC),miR-141-3p inhibitor,陰性對照寡核苷酸(anti-miR-NC)購自Ribo Bio公司(中國廣州)。按照Lipofectamine2000轉染步驟進行,轉染效率通過熒光顯微鏡計算熒光素標記細胞的百分比。

1.2.8 前列腺癌骨轉移動物模型構建 6周齡雄性Balb/c裸鼠分為兩組,分別尾靜脈注射轉染miR-141-3p mimics的前列腺癌骨轉移細胞MDA PCa 2b和未轉染MDA PCa 2b,每周3次,每次100 μg/只;注射3周后,兩組動物分別在右側股骨和脛骨骨內注射2.0×106轉染miR-141-3p mimics的MDA PCa 2b細胞和未轉染的MDA PCa 2b細胞,利用micro-CT觀察動物成瘤情況。

1.3 統計學分析

應用SPSS 18.0軟件(SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)進行統計學分析。采用Mann-WhitneyU檢驗分析非參數數據;采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗對參數數據進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-141-3p在血清中的差異表達

RT-PCR檢測前列腺癌骨轉移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清中miR-141-3p的表達水平,結果顯示,前列腺癌骨轉移患者血清miR-141-3p的表達水平顯著升高(見圖1)。

與健康對照比較，*P<0.05，**P<0.01;與局限性前列腺癌比較，##P<0.01圖1 前列腺癌骨轉移患者、局限性前列腺癌患者、健康人血清miR-141-3p的表達水平Figure 1 Serum levels of miR-141-3p in prostate cancer patients with bone metastasis, patients with localized prostate cancer and normal controls

2.2 細胞培養液miRNAs差異表達分析

前列腺癌骨轉移細胞株MDA PCA 2b與前列腺正常上皮細胞RWPE-1差異表達的50個miRNA聚類分析能完全區分兩株細胞(見圖2)。前列腺癌骨轉移細胞株MDA PCA 2b表達上調的前3名分別是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表達下調前3名分別是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p(見圖3)。

2.3 miR-141-3p靶基因預測

采用miRGator V3.0數據庫對miR-141-3p的靶基因及作用位點進行預測分析,結果顯示DLC1為miR-141-3p可能作用的靶分子(見圖4)。

藍色從淺到深變化意味表達量越低;紅色從淺到深變化意味表達量越高圖2 miRNA表達差異的熱圖Figure 2 Heatmap of miRNA differential expression

圖3 miRNA表達差異的火山圖Figure 3 Volcano plot of miRNA differential expression

圖4 miR-141-3pp的靶基因及作用位點預測Figure 4 Prediction of the miR-141-3p target gene

2.4 miR-141-3p靶基因驗證

靶基因驗證結果顯示，hsa-miR-141-3p mimic顯著下調DLC1野生型報告熒光,利用突變載體mut1將預測靶位點突變后其突變載體的報告熒光值升高;而利用突變載體mut2將預測靶位點突變后其突變載體的報告熒光值仍舊明顯下調,結果顯示hsa-miR-141-3p很可能通過突變載體mut1所突變的位點來調控靶基因的表達(見圖5)。為了進一步證實miR-141-3p對DLC1的靶向負調控作用,我們用miR-141-3p mimics和inhibitor轉染成骨細胞,結果顯示隨著miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表達顯著下降(P<0.01,見圖6)。

2.5 前列腺癌骨轉移動物模型構建

2個月后,轉染組的右腿股骨和脛骨處出現明顯骨轉移瘤,未轉染組未見明顯轉移瘤(見圖7)。

2.6 兩組裸鼠骨組織的病理染色結果

對兩組裸鼠的骨組織進行病理染色分析,HE染色發現轉染組骨轉移瘤病理表現為絕大部分成骨性改變成骨細胞增殖,腫瘤間質組織減少,骨小梁結構破壞,腫瘤細胞排列緊密,極性消失,核漿比例失調,病理性核分裂相多見;未轉染組骨小梁結構完整,可見較為明顯的骨髓腔結構,未見腫瘤細胞。ALP染色發現本實驗中轉染組可見大量ALP染色呈棕色的成骨細胞增殖;未轉染組ALP染色陽性細胞數量較少,且陽性程度較弱。Masson染色顯示轉染組骨組織成熟程度明顯增強。TRAP染色結果顯示轉染組破骨細胞分布較另外兩組明顯減少(見圖8)。免疫組化染色顯示轉染組骨組織中DLC1陰性表達,Cdc42、p38及OPG呈強陽性表達;未轉染組骨組織中DLC1呈陽性表達(見圖9)。

與DLC1-Mut1+NC比較,**P<0.01圖5 miR-141-3p靶基因驗證Figure 5 Identification of the miR-141-3p target gene

與mimics比較，**P<0.01圖6 miR-141-3p表達與DLC1的相關性Figure 6 The correlation between miR-141-3p expression and DLC1

A.轉染組可見大量云霧狀骨密度增高性陰影,呈成骨性改變;B.未轉染組未見明顯骨密度增高性陰影圖7 動物模型構建Figure 7 Mouse xenograft model establishment

圖8 兩組裸鼠骨組織的病理染色結果Figure 8 The pathological staining of bone tissues in two groups

免疫組化染色結果以細胞核內出現棕褐色或棕褐色顆粒為陽性結果圖9 兩組裸鼠的骨組織免疫組化染色結果Figure 9 The results of immunohistochemical staining of bone tissues in two groups

3 討論

前列腺癌在全世界范圍內已成為備受關注的公共健康問題。據統計,全球新發前列腺癌患者占新發癌癥患者總數的11.7%。miR-141屬于miR-200家族,位于人類的12號染色體(12p13.31),而腫瘤組織中經常出現該區域的點突變、易位及染色體缺失。miRNA-141的前體可以在細胞漿中經過剪切和加工產生miR-141-3p和miR-141-5p兩個成熟產物[9]。

Volinia等[10]在前列腺癌的研究中分析了56例腫瘤組織和7例非腫瘤組織,結果表明在前列腺癌中有39個miRNA上調,6個miRNA下調。Mitchell等[11]分析了50個人的血清標本,發現miR-141,miR-125b,miR-143和miR-296在轉移性前列腺癌組的血清中高表達,其中miR-141的差異最為顯著,其表達上調46倍。大量研究證實miRNA在前列腺癌發生及發展中表達失調,且前列腺癌患者與正常人群之間存在差異表達[12,13]。另有研究發現異常表達的exosomal miR-141-3p與前列腺癌骨轉移的發生有關[14,15]。在本研究中我們發現前列腺癌miR-141-3p的表達水平顯著升高且與轉移密切相關。本研究識別了前列腺癌骨轉移細胞株MDA PCA 2b與前列腺正常上皮細胞RWPE-1差異表達的50個miRNA聚類分析能完全區分兩株細胞。前列腺癌骨轉移細胞株MDA PCA 2b的exosomes表達上調的前3名分別是miR-375,miR-200c-3p和miR-141-3p;表達下調前3名分別是miR-100-5p,miR-584-5p和miR-125b-1-3p。

本研究中,靶基因驗證結果顯示hsa-miR-141-3p mimic顯著下調DLC1野生型報告熒光,且很可能是通過mut1所突變的位點來調控靶基因的表達。miR-141-3p mimics/inhibitor轉染成骨細胞,結果顯示隨著miR-141-3p水平的升高,DLC1在蛋白水平及mRNA水平表達顯著下降,進一步證實miR-141-3p對DLC1的靶向負調控作用。

前列腺癌骨轉移主要表現為成骨性骨轉移,其影像學表現呈棉團狀、牙質樣、磨玻璃狀的密度增高影。前列腺癌細胞與成骨/破骨細胞之間相互作用,打破正常的成骨/破骨細胞動態平衡最終發生成骨性骨轉移[16]。p38MAPK作為細胞內的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其信號轉導途徑是細胞外信號引起核內反應的重要通道,可被多種刺激因子激活,通過影響基因的轉錄和調控改變細胞的生物學行為[17]。研究發現p38MAPK在成骨細胞的增殖、分化、凋亡過程中起著重要的調控作用[18]。成骨分化相關基因OPG變化在調節成骨/破骨細胞之間的平衡中起到重要的作用[19]。

本研究利用動物實驗證明miR-141-3p顯著促進前列腺癌骨轉移,通過micro-CT、病理染色進一步證實miR-141-3p靶向抑制DLC1的表達進而激活Cdc42和P38 MAPK的磷酸化,從而使P38 MAPK信號通路激活,促進成骨活性基因表達,升高OPG表達,為前列腺癌成骨性骨轉移微環境的形成奠定了基礎。充分證實miR-141-3p在前列腺癌骨定向侵襲、骨轉移灶形成等過程中發揮重要作用。