槲皮素對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護作用

雷曉鳴,孟麗華,蔣文軍,李 雪,張珍妮

(西安交通大學第二附屬醫院麻醉科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:Jennyzzn@sohu.com)

I/R損傷發生在許多臨床情況下,機制非常復雜,涉及氧化應激、炎癥等許多因素,導致細胞的壞死或者凋亡[1]。氧化應激是I/R損傷的始動因素[2],有學者認為抗氧化劑需要同時具備多個作用靶點和容易穿過血腦屏障的特點,在I/R損傷的治療中才有更好的臨床前景[3]。槲皮素可以從蔬菜、水果中提取,抗氧化能力是其保護神經功能的基礎,近年來研究發現其具有減輕局灶性腦I/R損傷的作用[4]。低血壓、休克、心跳驟停等導致的全腦I/R損傷是導致患者進行性認知功能障礙、殘疾甚至死亡的重要原因[5],槲皮素對全腦I/R損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究利用全腦性I/R損傷模型,觀察槲皮素對全腦I/R損傷大鼠的作用,為槲皮素的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

健康成年雄性SPF級SD大鼠216只,8-10周齡,體質量(300±20)g,由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供(動物許可證號:SCXK(陜)2015-003)。槲皮素(美國Sigma公司,dH2O/0.1% Tween-80配成所需濃度),伊文氏藍(河北博海生物工程開發有限公司),水合氯醛(西安交通大學第二附屬醫院),4%多聚甲醛(天津市博迪化學有限公司),DAB顯色試劑盒(北京中山金橋公司),DCFH-DA(美國Sigma公司),引物合成(大連寶生物公司),TRIzol(美國Invitrogen公司),PrimeScript RT-PCR Kit(大連寶生物公司),Premix Ex TaqTMVersion 2.0(大連寶生物公司),大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α檢測ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2 模型制備及實驗分組

采用4-VO法建立SD大鼠全腦I/R損傷模型。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉,枕骨下第一頸椎水平正中切口,暴露第一頸椎橫突,通過翼小孔,燒灼雙側椎動脈并使其閉塞。24 h后,仰臥位取頸部正中切口,暴露并游離雙側頸總動脈,無創動脈夾夾閉15 min,然后開放動脈夾恢復血流灌注。

216只雄性SD大鼠隨機分為假手術+vehicle組(sham組)、I/R+vehicle組(I/R組)、I/R+槲皮素5 mg/(kg·d)組(低劑量組)及I/R+槲皮素10 mg/(kg·d)組(高劑量組)。采用4-VO法建立全腦I/R模型,sham組暴露雙側椎動脈以及頸總動脈后予以縫合。四組大鼠均在造模前3 d開始灌胃,sham組和I/R組均以0.1%的Tween80(1 ml/100 g)灌胃,低劑量組和高劑量組分別以0.05%[5 mg/(kg·d)]、0.1%[10 mg/(kg·d)]的槲皮素溶液(1 ml/100 g)灌胃,1次/d,持續至觀察結束當天。

1.3 HE染色觀察海馬CA1區病理形態學變化

每組6只大鼠。再灌注24 h,將灌注針頭插入左心室,4%多聚甲醛的PBS液灌注。開顱取腦,分離海馬組織,在4%多聚甲醛溶液中固定24 h,常規石蠟包埋,HE染色。

1.4 NDS評估神經功能

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時,根據Cao等[6]的方法,進行NDS評分。

1.5 干濕重法檢測腦含水量

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時,麻醉后處死大鼠,開顱取腦,留取左側大腦半球,測濕腦組織質量(wet weight,WW),烘烤24 h至恒重,稱取干腦組織質量(dry weight,DW)。腦組織含水量=(WW-DW)/WW×100%。

1.6 EB法檢測血腦屏障(BBB)通透性

每組6只大鼠。分別在再灌注12,24,48 h時,麻醉后經股靜脈注射2% EB(3 ml/kg),注射后1 h灌注生理鹽水處死。開顱取腦,制作2 mm厚冠狀切片,置于二甲基甲酰胺溶液,37 ℃恒溫振蕩水浴箱放置48 h,制作勻漿,10 000g離心20 min,用乙醇按1 ∶3的比例稀釋上清液。用分光光度計在波長632 nm處測定各標本的OD值。根據標準曲線計算出EB含量。

1.7 DCFH-DA法檢測海馬細胞活性氧(ROS)含量

每組6只大鼠。分別在再灌注2,12,24 h時,麻醉后處死大鼠,分離海馬組織,滴加4 ℃ PBS溶液,研磨1 min,過濾,取上清液,2 000g離心5 min,清洗,PBS重新懸浮細胞,制備1×106/ml的細胞懸液,加入DCFH-DA探針,5% CO2細胞培養箱避光孵育,采用488 nm為激發波長,525 nm為發射波長,檢測細胞中熒光強度。根據DCF的標準曲線計算ROS的水平。

1.8 real-time PCR檢測海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA水平

1.9 ELISA法檢測海馬組織和血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達

每組6只大鼠。分別在再灌注2,12,24,48 h時,麻醉后處死大鼠,取腦,分離海馬組織,制備組織勻漿;麻醉后從心臟抽取靜脈血約5 ml,加入EDTA抗凝管中靜置10 min,2 000 r/min離心20 min,將血清標本收集于1.5 ml EP管中。加入50 μl待測樣品,混勻,溫育60 min,加50 μl酶標抗體工作液,37 ℃反應90 min,加100 μl底物工作液,暗處反應10 min,最后加入終止液50 μl,在492 nm處測吸光值。根據吸光值在標準曲線上查出其含量。

表1 各個基因引物序列

Table 1 Primer sequences of genes for real-time PCR

基因名稱 引物序列(5′-3′)產物長度(bp) IL-6CATTCTGTCTCGAGCCCACC98 GCAACTGGCTGGAAGTCTCT IL-1βCCTTGTCGAGAATGGGCAGT120 CAGGGAGGGAAACACACGTT TNF-αCATCCGTTCTCTACCCAGCC125 CCCAGAGCCACAATTCCCTT IFN-γATGCATTCATGAGCATCGCC104 AGATTCTGGTGACAGCTGGTG β-actinGCAGGAGTACGATGAGTCCG74 ACGCAGCTCAGTAACAGTCC

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 海馬CA1區病理學結果

sham組海馬CA1區結構清晰,細胞排列整齊、致密,形態正常。IR組海馬CA1區細胞數量減少,排列紊亂、稀疏,胞體縮小。與I/R組相比,低劑量組和高劑量組海馬CA1區損傷明顯減輕,結構較為清晰,細胞數量及形態較為正常(見圖1)。

2.2 NDS評分結果

I/R組12,24,48 h的NDS評分較sham組顯著下降(P<0.05),而低劑量組及高劑量組NDS評分均顯著高于I/R組(P<0.05,見圖2)。

2.3 腦組織EB含量檢測結果

與sham組相比,I/R組12,24,48 h EB含量顯著升高(P<0.05)。再灌注24 h和48 h,低劑量組和高劑量組EB含量較I/R組顯著降低(P<0.05,見圖3)。

A.sham組;B.I/R組;C.低劑量組;D.高劑量組圖1 再灌注24 h海馬CA1區HE染色結果 (×400)Figure 1 HE staining of hippocampal CA1 at 24 h after reperfusion in different groups (×400)

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖2 各組再灌注12,24,48 h NDS評分的比較Figure 2 Comparison of NDS scores at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖3 各組再灌注12,24,48 h EB含量的比較Figure 3 Comparison of EB content at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

2.4 腦含水量檢測結果

再灌注12,24,48 h時I/R組腦組織含水量均顯著高于sham組(P<0.05)。而在24 h和48 h,低劑量組和高劑量組的腦含水量較I/R組顯著降低(P<0.05,見圖4)。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05圖4 各組再灌注12,24,48 h腦含水量的比較Figure 4 Comparison of brain water content at 12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

2.5 ROS含量檢測結果

I/R組再灌注2,12,24 h ROS含量顯著高于sham組(P<0.05);再灌注2 h和12 h,低劑量組和高劑量組ROS含量均顯著低于I/R組(P<0.05),而在24 h,高劑量組則顯著低于I/R組(P<0.05,見圖5)。

2.6 real-time PCR法檢測海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA結果

與sham組相比,I/R組IL-1β mRNA、TNF-α mRNA以及IL-6 mRNA在再灌注2,12,24,48 h均顯著升高(P<0.05),高劑量組在各時點均較I/R組顯著降低(P<0.05);再灌注24 h和48 h,I/R組IFN-γ mRNA較sham組顯著升高(P<0.05),而低劑量組和高劑量組較I/R組顯著降低(P<0.05,見圖6)。

2.7 ELISA法檢測海馬組織和血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達的結果

與sham組相比,I/R組IL-1β、TNF-α以及IL-6在再灌注2,12,24,48 h均顯著升高(P<0.05);與I/R組相比,低劑量組和高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6在再灌注后各時間點表達顯著降低(P<0.05)。再灌注24 h和48 h,I/R組IFN-γ表達較sham組顯著升高(P<0.05),而低劑量組和高劑量組較I/R組顯著降低(P<0.05,見圖7,8)。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖5 各組再灌注2,12,24 h海馬細胞ROS含量的比較Figure 5 Comparison of ROS content in hippocampus cells at 2,12 h and 24 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖6 各組再灌注2,12,24,48 h海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ mRNA水平的比較Figure 6 Comparison of mRNA levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in hippocampus tissue at 2,12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

3 討論

I/R損傷涉及氧化損傷、炎癥反應等一系列病理機制,是全腦性缺血后功能障礙甚至死亡的重要原因[6]。槲皮素具有抗氧化能力,近年來發現其具有減輕腦I/R損傷的作用,受到研究者的關注。

已經證實,海馬、大腦皮層椎體細胞、紋狀體和小腦浦肯野細胞是腦組織內對缺血缺氧最為敏感的區域或細胞,尤其是海馬CA1區[7]。本研究HE染色結果顯示,I/R組海馬CA1區組織損傷較重,細胞排列紊亂,數量減少,核皺縮,核仁消失,低劑量組和高劑量組細胞層數及數量增多,形態較為正常,與I/R組相比,CA1區破壞程度顯著減輕。提示槲皮素能夠減輕全腦I/R導致的組織損傷。

國際中風治療臨床前研究指南指出,在腦缺血性損傷的藥物研究中應選擇多重指標,評價應包括組織和行為學結果。腦I/R損傷后,可出現一系列神經行為學的異常,通常與運動、感覺和認知功能障礙等相關,通過量化統計動物神經行為學差異可間接反映其大腦損傷程度,在腦缺血的研究中非常重要,NDS評分則屬于神經功能缺損評分。本研究采用NDS來評價大鼠全腦I/R損傷后的神經功能。結果顯示,I/R組大鼠NDS評分顯著低于sham組,提示全腦I/R后大鼠的神經功能受到損傷,而操良斌等[8]學者的研究結果亦顯示全腦I/R后大鼠NDS明顯降低,和本實驗研究結果一致。而低劑量組和高劑量組在再灌注后12 h、24 h和48 h的NDS評分均顯著高于I/R組,提示槲皮素可以改善全腦I/R導致的大鼠神經功能損傷。

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖7 各組再灌注2,12,24 h和48 h海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ表達的比較Figure 7 Comparison of expression of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in hippocampus tissue at 2,12, 24 h and 48 h after reperfusion among different groups

與sham組相比,*P<0.05;與I/R相比,#P<0.05圖8 各組再灌注2,12,24 h和48 h血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平Figure 8 Comparison of level of IL-1β, TNF-α, IL-6 and IFN-γ in serum at 2,12,24 h and 48 h after reperfusion among different groups

腦缺血性損傷等均可以引起BBB通透性的改變,既是繼發性損傷,也是損傷的重要機制[9]。MMPs的活化尤其是MMP-9表達增加是I/R后導致BBB損傷的重要機制[10]。在使用MCAO法制備的大鼠局灶性腦缺血模型的研究中,Lee等[11]發現,槲皮素能夠通過抑制MMP-9的表達改善大鼠局灶性腦缺血損傷的預后。腦I/R后BBB遭到破壞,導致血液成分滲入腦組織,形成血管源性腦水腫,與細胞毒性腦水腫一起加重繼發性損傷。本實驗使用4-VO制備全腦I/R模型,結果顯示,再灌注12,24,48 h,I/R組大鼠腦組織EB含量和腦含水量顯著增高,表明全腦I/R損傷后BBB通透性增高,與以往研究結果一致[12]。而低劑量組和高劑量組在24 h和48 h,EB含量和腦含水量顯著低于I/R組,說明槲皮素可有效降低BBB的通透性。

黃酮類的羥基結構決定了其具有清除ROS、鰲合金屬離子等藥理活性。Dai等[14]的研究建立體內和體外腦I/R損傷模型,顯示異槲皮素通過Nrf2-介導,抑制NOX4/ROS/NF-κB信號通路,抑制氧化應激和神經細胞凋亡[13]。口服槲皮素負載的聚合物納米膠囊,通過抑制ROS,保護線粒體結構和功能,抑制大鼠腦缺血再灌注損傷ROS介導細胞凋亡,從而起到神經保護作用。本實驗結果顯示,在全腦I/R后2 h,12 h和24 h,I/R組大鼠海馬細胞內ROS含量顯著高于sham組,而低劑量組和高劑量組ROS含量則較I/R組顯著降低,表明槲皮素能夠抑制全腦I/R后ROS的生成,與既往研究結果一致。證實了槲皮素能夠抑制全腦I/R損傷后的氧化應激反應。

隨著關于腦I/R損傷免疫機制研究的深入,炎癥細胞和炎性因子在腦I/R損傷中的作用日益受到關注。有研究發現,槲皮素治療聯合人臍帶間充質質細胞移植,抑制促炎因子IL-1β和IL-6,增加IL-4、IL-10和TGF-β1,可顯著改善局灶性腦缺血大鼠神經功能的恢復[15]。Wang等[4]的研究觀察異槲皮素在原代培養的大鼠海馬神經元的氧糖剝奪再灌注模型和大鼠短暫性大腦中動脈閉塞再灌注模型的神經保護作用,結果表明,異槲皮素通過抑制TLR4,NF-κB和caspase-1的激活,ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化,抑制TNF-α、IL-1β和IL-6,調控Bax、Bcl-2和caspase-3的表達,降低I/R損傷后的梗死面積、炎癥反應、氧化應激及凋亡細胞數量。

本實驗結果顯示,與I/R組相比,低劑量組的IL-1β mRNA在48 h,TNF-α mRNA在2 h,IL-6 mRNA在2 h和12 h,與I/R組相比無顯著性差異,其余各時間點mRNA水平以及各時間點蛋白表達均較I/R組顯著降低。高劑量組在各時間點IL-1β、TNF-α以及IL-6 mRNA水平和蛋白水平均顯著低于I/R組。ELISA檢測海馬組織和血清結果亦表明,低劑量組和高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6在再灌注后各時間點較I/R組顯著降低。提示槲皮素可抑制全腦I/R損傷后IL-1β、TNF-α以及IL-6的表達。

I/R后,炎癥因子既可以在腦組織內產生,也可以來源于外周免疫系統。Chang等[16]在局灶性腦缺血模型發現,腦缺血后IFN-γ在腦組織和外周血中表達均升高,與損傷關系密切。Seifert等[17]在局灶性腦缺血模型發現,來源于脾臟的IFN-γ加重了腦組織損傷。本實驗結果顯示I/R組大鼠腦組織中IFN-γ mRNA在全腦I/R后2 h和12 h與sham組無顯著性差異,24 h開始升高,而在血清和腦組織出現同樣的結果。說明腦組織增多的IFN-γ可能來源于外周免疫系統,BBB受損后進入腦組織。同時ELISA檢測海馬組織和血清結果發現低劑量組和高劑量組IFN-γ在24 h和48 h的表達較I/R組明顯降低。說明槲皮素也可以抑制IFN-γ的表達。

綜上所述,槲皮素能夠改善大鼠全腦I/R后神經功能損傷,減輕血腦屏障損傷和腦水腫,減少ROS生成,抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達,減輕組織損傷。