PPAR-γ介導FAK在肺動脈平滑肌細胞遷移調控中的機制研究

張德信,胡勁松,李少軍,張永紅,王 珂,李滿祥

(1西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710004;2西安交通大學醫學院;3西安交通大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科;*通訊作者,E-mail:dexin1994@mail.xjtu.edu.cn)

在肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)進展過程中,肺血管重構是其重要的病理基礎,而血管內皮損傷后所致的肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)向內膜遷移,最終致使內膜增厚被認為是PAH主要病理機制之一[1]。所以,抑制PASMCs遷移,就可以抑制PAH的發生和發展。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化是細胞遷移及侵襲過程中重要因素,其功能在腫瘤的侵襲機制中得到廣泛的研究[2]。FAK可以調節細胞的吸附、肌動蛋白聚合和骨架重組等生理過程,從而促進細胞遷移和侵襲。在PAH發病機制中,FAK是否參與平滑肌細胞遷移,需要進一步研究證實。本研究利用PDGF-BB刺激PASMCs,促進其受體PDGF-βR磷酸化,再分別給予FAK拮抗劑Y15及PPAR-γ激動劑羅格列酮,觀察不同干預對于PASMCs遷移的影響,并檢測激活PPAR-γ后,PDGF-βR及FAK(Tyr397)磷酸化水平的變化,證實PPAR-γ、PDGF-βR和FAK在平滑肌細胞遷移中的關系。進一步研究PASMCs遷移的分子調控機制,探索抑制PASMCs遷移的分子通路,為PAH靶向治療提供新依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

清潔級4-6周雄性SD大鼠,體質量150-200 g,由西安交通大學實驗動物中心提供。青霉素(哈爾濱制藥廠),鏈霉素(華東制藥廠),0.25%胰酶、DMEM-12培養基、標準胎牛血清(美國HyClone公司);兔抗大鼠α-SMA(美國Abcam公司);DAB顯色試劑(北京中山生物技術公司);預鋪Ma-trigel膠的Transwell小室(美國Corning公司);重組人血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)、抗p-PDGF-βR(Tyr751,美國Cell Signaling公司);抗p-FAK(Tyr397)抗體(美國Life Technologies);1,2,4,5-苯四胺鹽酸鹽(Y15,美國sigma公司);Rosiglitazone(美國Cayman公司)。

1.2 大鼠PASMCs的原代培養、鑒定

頸椎脫臼法處死SD大鼠,無菌分離肺動脈中膜層,剪切后的組織塊貼壁于培養瓶,加入DMEM-12培養基(含20% FBS),37 ℃、5% CO2培養。組織塊長出細胞后,根據細胞形態、免疫組化檢測血管平滑肌細胞表型標志基因α-SMA的表達,鑒定PASMCs。取第3-7代細胞用于實驗。

1.3 實驗分組及處理

取傳代培養3-7代細胞用于實驗,接種PASMCs(約5×104/孔)于6孔板,當細胞融合度約40%-60%時,換用無血清DMEM-12培養基,同步化處理24 h,將細胞分為CON組、PDGF-BB組、Y15組和ROSI組。CON組:加入含10% FBS的高糖DMEM-12培養基,不加入刺激因子及抑制劑;PDGF-BB組:根據預實驗結果,細胞同步化后加入20 ng/ml PDGF-BB刺激1 h,裂解細胞,提取蛋白,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。Y15組:同步化后加入PDGF-BB(20 ng/ml)預刺激1 h,再加入FAK抑制劑Y15(10 μmol/L)刺激2 h后裂解細胞,提取蛋白,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(TYR397)磷酸化水平。ROSI+PDGF-BB組:依據預實驗結果,同步化后加入羅格列酮10 μmol/L預處理1 h后加入20 ng/ml的PDGF-BB刺激1 h,收集細胞,Western blot檢測PDGF-βR和FAK(Tyr397)磷酸化水平。

1.4 劃痕實驗

將2×106個PASMCs接種于6孔板,常規培養至90%的融合狀態,用10 μl Eppendorf Tip在細胞板上劃痕,按實驗分組加入相應試劑,37 ℃,5% CO2培養48 h,在0、48 h取樣拍照,進行組間比較。隨機選擇3個區域,計算遷移率。遷移率(%)=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.5 細胞遷移實驗

采用Transwell培養板進行體外細胞遷移實驗:將Transwell放在24孔板內,細胞計數后,配制細胞懸液;在上室每孔加入100 μl DMEM-12無血清培養基;下腔室中加入500 μl含有100 ml/L FBS條件培養基;在上室每孔加入相應干預因子的細胞1.0×105個,孵育24 h;顯微鏡下觀察。200倍高倍視野計數遷移至濾膜下表面的細胞數,反映PASMCs遷移能力。隨機計數3個視野內的細胞數,取平均值進行組間比較,實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)磷酸化程度

將各組細胞裂解液提取的蛋白樣品用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度,稀釋后用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,濕法轉印,ECL化學發光顯色,暗室中拍片,以β-actin作為內參,將結果掃描成電子圖像,以Quantity One分析軟件(Bio-Rad,USA)分析圖像。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 PASMCs的培養及鑒定

大部分組織塊接種培養3 d左右,組織塊周圍有細胞呈放射狀生長,早期細胞形態大小不一。經反復傳代及純化,第4代時平滑肌細胞純度可達95%以上。顯微鏡下單個平滑肌細胞呈梭形或帶狀,有多個細胞突起。細胞生長致密時平行排列成束,部分重疊。培養第5代的細胞,經特異的α-actin免疫化學染色后證實為平滑肌細胞。

2.2 劃痕實驗檢測PASMCs遷移結果

PDGF-BB組PASMCs經20 ng/ml PDGF-BB干預48 h后,遷移能力明顯提高,表現為劃痕區域的面積變化(77.3%±4.2%)高于CON組(61.3%±3.5%,P<0.05)。經PDGF-BB和FAK抑制劑Y15共同處理后,Y15組劃痕區域的面積較PDGF-BB干預組變化明顯減小(72.7%±4.7%vs77.3%±4.2%,P<0.05);經PDGF-BB和羅格列酮共同處理后,ROSI組劃痕區域的面積變化較PDGF-BB干預組明顯減小(75.3%±4.04%vs77.3%±4.2%,P<0.05),但與Y15組比較,劃痕區域的面積變化差異無統計學意義(75.3%±4.04%vs72.7%±4.70%,P>0.05,見圖1)。

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05圖1 劃痕試驗檢測各組細胞在Y15干預、激活PPAR-γ后對于PDGF-BB誘導的PASMCs遷移的影響Figure 1 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on PDGF-BB-induced migration of PASMCs by scratch test

2.3 Transwell遷移小室實驗結果

PDGF-BB可明顯增加PASMCs細胞穿過微孔濾膜的能力,與CON組比較差異有統計學意義(70.7±3.1vs48.7±2.2,P<0.05)。而在上室加入PDGF-BB和FAK抑制劑后,Y15組細胞穿膜數較PDGF-BB組明顯減少(70.7±3.1vs51.0±1.3,P<0.05);經PDGF-BB和羅格列酮共同處理后,ROSI組細胞穿膜數較PDGF-BB組也明顯減少(70.7±3.1vs48.7±2.9,P<0.05),但與Y15組比較,穿膜細胞數變化差異無統計學意義(51.0±1.3vs48.7±2.9,P>0.05,見圖2)。

2.4 Western blot檢測PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平

PDGF-BB可明顯提高PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化程度。與CON組比較,PDGF-BB組p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表達差異有統計學意義(P<0.05);給予Y15干預后,同PDGF-BB組比較,Y15組p-PDGF-βR表達差異無統計學意義(P>0.05),而p-FAK(Tyr397)則明顯降低(P<0.05);給予羅格列酮干預后,與PDGF-BB組比較,p-PDGF-βR、p-FAK(Tyr397)表達水平均降低,差異具有顯著性(P<0.05,見圖3)。

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05圖2 Transwell遷移小室檢測對各組細胞在Y15干預、激活PPAR-γ后對于PDGF-BB誘導的PASMCs侵襲能力的影響Figure 2 Effect of Y15 intervention and activation of PPAR-γ on invasive ability of PAGF-BB-induced PASMCs by Transwell migration chamber assay

與CON組比較，#P<0.05；與PDGF-BB組比較，*P<0.05；與Y15組比較，△P<0.05圖3 Western blotting檢測Y15干預、激活PPAR-γ后，p-PDGF-βR、p-FAK(Y397)磷酸化水平的變化Figure 3 Changes of phosphorylation levels of p-PDGF-βR and p-FAK(Y397) after Y15 intervention and activation of PPAR-γ by Western blotting

3 討論

PASMCs遷移和增殖是PAH發生發展的重要環節,抑制PASMCs遷移和增殖是目前治療PAH發生和發展的重要策略。本課題組近期的研究結果提示,通過激活PPAR-γ,可上調血紅素加氧酶-1(HO-1)蛋白的表達,上調的HO-1又可上調周期蛋白p21(WAF1)的表達,最終可抑制血管平滑肌細胞的增殖[3]。本實驗利用羅格列酮激活PPAR-γ后,研究其對于PASMCs遷移作用及可能機制。PASMCs的遷移需要化學趨化劑,再通過多種分子通路,使PASMCs向血管內膜遷移,參與血管重構。PDGF-BB就是最為重要的驅化劑之一[4]。本實驗利用PDGF-BB作為趨化因子,刺激PASMCs遷移,研究激活PPAR-γ后對于PASMCs遷移的影響及可能的機制。本實驗結果提示,激活PPAR-γ可明顯抑制PASMCs的遷移,這種抑制作用部分機制可能是通過抑制PDGF-βR磷酸化,進一步抑制FAK(Tyr397)磷酸化水平而實現的。

PAH病因復雜,參與其發病的因素包括肺血管收縮與重構,肺血管平滑肌和內皮細胞的異常增殖,血栓形成及遺傳基因變異等[5]。肺血管內皮細胞的增殖遷移是其重要環節,這一過程與PPAR-γ關系密切[6]。研究發現,PAH患者的PPARγ的表達無論在基因水平還是在蛋白水平都有明顯降低;在對重癥PAH的肺組織進行抗PPARγ單克隆抗體的免疫染色時,發現肺血管的叢樣病變處PPAR-γ的表達明顯減少[7]。在PAH動物模型中,激活PPAR-γ后,肺動脈壓力明顯降低,這一作用是通過降低PASMCs的增殖和遷移實現的[8]。

FAK在多種細胞的遷移、增殖、分化、凋亡等的調節中具有關鍵作用,是細胞周期的正向調節因子。過度表達的FAK不但可以增加DNA的合成,促進細胞增殖,還可以促進細胞遷移;突變的FAK則可以抑制細胞遷移[9]。目前研究較多的是FAK在腫瘤細胞轉移過程中的作用[10]。FAK磷酸化是調控細胞遷移的基礎,而在所有FAK磷酸化位點中,FAK(Tyr397)的磷酸化處于核心位置,其磷酸化后可催化FAK的Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861和Tyr925等位點磷酸化,最終使FAK完全活化[11]。研究證實,血小板衍生生長因子PDGF-BB可引起血管平滑肌細胞FAK表達升高與活化,而活化的FAK可通過多種途徑促進細胞遷移及增殖[12]。而這一作用機制是否參與到PAH的形成過程中,并沒有得到證實。本實驗結果提示,PASMCs經PDGF-BB干預后,遷移能力明顯提高,表現為劃痕區域的面積變化和Transwell遷移小室遷移細胞數明顯高于CON組,且PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平明顯較CON組提高,提示PDGF-BB可通過促進PDGF-βR磷酸化,進而提高FAK磷酸化水平,促進PASMCs遷移。給予FAK拮抗劑Y15干預后,PASMCs遷移能力減弱,同時伴有FAK(Tyr397)磷酸化水平明顯降低,PDGF-βR磷酸化水平無明顯變化,提示磷酸化的FAK參與到PASMCs遷移過程中。再次激動PPAR-γ后,PASMCs遷移再次受到抑制,而PDGF-βR、FAK(Tyr397)磷酸化水平同PDGF-BB組比較顯著降低。本實驗結果提示,激動PPAR-γ可以抑制肺動脈高壓的形成,部分原因可能是通過抑制PDGF-βR磷酸化,進而抑制FAK的磷酸水平,最終抑制PASMCs的遷移來實現的。

盡管本實驗結果證實了激動PPAR-γ抑制PASMCs遷移的可能機制,但激動PPAR-γ抑制PASMCs遷移尚存在多個信號通路、關鍵的靶蛋白及對應的靶基因[13,14],仍需通過相關抑制劑或基因沉默干擾技術進一步研究,從而更好地理解PPAR-γ在PAH治療中的作用機制。