二甲雙胍對LPS誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

王貴佐,韓 冬*,張 薇,張葉欽,王少純,張永紅

(1陜西省人民醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710068;2西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重醫學科;*通訊作者,E-mail:sesory@yeah.net)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由心源性以外的各種肺內、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭,其主要病理特征為肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,通透性增高,富含蛋白質的液體大量滲出,造成彌漫性肺泡及肺間質水腫,進而透明膜形成,甚至出現肺間質纖維化[1]。目前研究發現ALI/ARDS的發病機制包括炎癥反應/抗炎反應、氧化反應/抗氧化反應的失衡,其發病率及病死率極高,尚無有效的治療藥物[2]。因此,開發新的治療藥物對于ALI/ARDS的治療具有重要的臨床實踐意義。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,AMPK可促進ATP的產生,抑制分解,是廣泛參與人體糖、蛋白質和脂肪代謝的重要蛋白激酶。AMPK常見的激動劑有二甲雙胍及AICAR等[3],研究發現,激活腺苷酸活化蛋白激酶可對急性肺損傷動物模型發揮保護作用[4],其作用機制尚待研究。對糖尿病小鼠模型研究發現,激活AMPK可以上調PGC1α的表達,增強抗氧化能力,減輕糖尿病腎病損害[5]。然而激活AMPK對急性肺損傷的保護作用是否通過上調PGC1α尚不明確。

在本研究中,通過LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型,評估二甲雙胍激活AMPK信號通路對急性肺損傷發揮保護作用及可能的機制,為急性肺損傷治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

6-8周齡雄性SPF級BALB/c小鼠(動物生產許可證SYXK(陜)2016-006),體質量20-25 g,由陜西省人民醫院實驗中心提供。二甲雙胍(格華止,國藥準字H20023371),由上海施貴寶制藥有限公司提供。脂多糖[Lipopolysaccharide(LPS),Escherichia coli 055:B5]購于Sigma-Aldrich。兔抗鼠AMPK、p-AMPK一抗購于美國Cell Signaling Technology公司,兔抗鼠PGC1α抗體來源于美國Novus Biological,HRP偶聯的羊抗兔抗體由美國Sigma-Aldrich提供,髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 模型制作和實驗分組

6-8周齡雄性BALB/c小鼠15只隨機分為:對照組,氣管內滴注無菌PBS 60 μl,作用24 h;LPS模型組(LPS),氣管插管,氣道內滴注1 mg/ml LPS 60 μl,作用24 h;二甲雙胍組(Met+LPS),在氣管插管氣道滴注LPS前30 min,腹腔注射二甲雙胍(250 mg/kg),再氣管內滴注1 mg/ml LPS 60 μl,作用24 h。小鼠均在陜西省人民醫院實驗中心SPF級動物房飼養,氣道給藥24 h后處死小鼠。

1.3 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺組織樣本采集

造模后24 h,腹腔注射10%水合氯醛0.8 ml/100 g處死小鼠,用4 ℃預冷無菌PBS 0.7 ml支氣管肺泡灌洗,重復灌洗3次,支氣管肺泡灌洗液的回收率達80%。BALF在4 ℃,1 000g,離心10 min。分別收集上清和沉淀,BALF上清液在-80 ℃保存備用。細胞沉淀用無菌PBS重新重懸,利用細胞計數板進行細胞計數。取細胞沉淀涂片,瑞氏染色,計數中性粒細胞。分離右肺組織并在-80 ℃保存。

1.4 肺組織病理學檢查

取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,石蠟包埋,切片(5 μm),蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學變化。

1.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測

MPO活性是中性粒細胞功能標志和啟動標志，肺組織內中性粒細胞大量聚集可導致MPO活性明顯升高。稱取一定重量的肺組織，加入5倍體積4 ℃預冷的生理鹽水，利用超聲法制作組織勻漿，利用南京建成生物工程研究所提供的MPO檢測試劑盒在460 nm波長處進行比色測定，從而得出MPO的活力，其活力高低反映炎癥的嚴重程度。

1.6 免疫印跡法檢測PGC1α、AMPK及p-AMPK

精密稱取各組小鼠肺組織,根據RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿,肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5 μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨。在冰上裂解1 h后,14 000g離心20 min,取上清,利用Western blot檢測各組小鼠肺組織PGC1α(1 ∶800)表達、AMPK(1 ∶500)及p-AMPK(1 ∶500)變化,PGC1α表達應用GAPDH(1 ∶5 000)作為內參校正。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 二甲雙胍對肺組織病理改變的影響

LPS模型組內皮細胞和上皮細胞被嚴重破壞,肺水腫、肺出血及以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內大量浸潤,肺部正常的組織形態結構消失;二甲雙胍治療組顯著抑制LPS誘發的肺組織上述改變;對照組未見小鼠肺組織內明顯的炎癥反應(見圖1)。

A.對照組 B.LPS組 C.Met+LPS組圖1 二甲雙胍對LPS誘導小鼠急性肺損傷病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of metformin on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice (HE staining,×200)

2.2 二甲雙胍對小鼠肺組織浸潤炎癥細胞數的影響

與對照組相比,氣道內滴注LPS后24 h,BALF 中的炎癥細胞總數顯著升高(P<0.01),與之相對應的是肺組織內中性粒細胞數同樣顯著升高(P<0.01),而應用二甲雙胍預處理后,以中性粒細胞為主的炎癥細胞總數在肺組織內的浸潤顯著減輕(見圖2)。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖2 二甲雙胍對小鼠支氣管肺泡灌洗液內浸潤炎癥細胞數的影響 (n=4)Figure 2 Effect of metformin on inflammatory cell numbers in BALF of mice (n=4)

2.3 二甲雙胍對MPO活性的影響

與對照組相比,LPS模型組肺組織內代表中性粒細胞聚集數目的MPO活性顯著升高(P<0.01,見圖3),給予二甲雙胍預處理后,MPO活性顯著下降。提示AMPK激動劑二甲雙胍預處理可顯著減輕LPS誘導小鼠急性肺損傷炎癥反應程度。

2.4 二甲雙胍對肺組織內PGC1α表達的影響

進一步探討AMPK激動劑二甲雙胍對過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)表達的影響。Western blot結果顯示，與對照組比較,LPS模型組小鼠肺組織內PGC1α的表達明顯減少,應用二甲雙胍提前干預處理后,肺組織內PGC1α表達較前顯增加(見圖4)。提示二甲雙胍可誘導PGC1α的表達。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖3 二甲雙胍對肺組織內MPO活性的影響 (n=4)Figure 3 Effect of metformin on MPO activity in lung tissues (n=4)

2.5 二甲雙胍對急性肺損傷小鼠肺組織AMPK磷酸化水平的影響

AMPK是二甲雙胍的主要分子靶點。因此本研究中探討二甲雙胍在LPS誘導的急性肺損傷模型中,對AMPK磷酸化水平的影響。Western blot結果顯示,與對照組比較,LPS模型組小鼠肺組織內P-AMPK的水平明顯下降,應用二甲雙胍提前干預處理后,肺組織內P-AMPK水平較前顯著增加(見圖5)。提示二甲雙胍可顯著增加肺組織內p-AMPK水平。

與對照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.05圖4 Western blot檢測二甲雙胍對肺組織內PGC1α表達的影響 (n=3)Figure 4 Effect of metformin on the expression of PGC1α in lung tissue by Western blot (n=3)

與對照組比較,*P<0.01;與LPS模型組比較,#P<0.01圖5 Western blot檢測二甲雙胍對肺組織內AMPK磷酸化水平的影響 (n=3)Figure 5 Effect of metformin on phosphorylation of AMPK in lung tissue by Western blot (n=3)

3 討論

本研究提示二甲雙胍通過激活AMPK對LPS誘導的小鼠急性肺損傷發揮保護作用,同時研究顯示這種保護作用伴隨PGC1α表達的增加。這為研究激活AMPK對急性肺損傷的保護作用提供了新的可能機制,為急性肺損傷治療提供新的策略。

二甲雙胍是AMPK的有效激動劑。目前主要用于2型糖尿病的治療,在臨床中應用已有50余年,具有良好的安全性和性價比。臨床研究發現應用二甲雙胍治療的糖尿病患者血清中,C反應蛋白和炎癥因子的水平顯著下降[6,7],這提示二甲雙胍在降低血糖的同時也抑制了患者體內異常的炎癥反應,提示AMPK激動劑除具有降糖作用外,可能還具有抗炎的作用。研究發現配體激活AMPK在多種細胞類型中具有抗炎和免疫抑制作用,因此在多種疾病的治療中具有潛在價值[8-10]。研究發現AICAR和berberine通過激活AMPK信號通路對LPS誘導急性肺損傷小鼠發揮保護作用[11]。Tsaknis等[12]研究發現二甲雙胍可通過降低肺泡微血管通透性從而對機械通氣誘導的小鼠肺損傷發揮保護作用。然而激活AMPK對上述疾病保護作用的具體機制尚待研究。本研究同樣提示二甲雙胍通過激活AMPK從而對LPS誘導小鼠急性肺損傷發揮保護作用。這種保護作用表現在以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內浸潤顯著減少,脂質過氧化產物MDA含量明顯下降,這提示二甲雙胍通過激活AMPK從而對LPS誘導小鼠急性肺損傷發揮保護作用。

本研究進一步探索了激活AMPK對急性肺損傷發揮保護作用的機制。過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)是生物體重要共激活轉錄因子,研究發現沉默PGC1α可導致抗氧化防御體系的酶(SOD1和SOD2等)表達下降,抗氧化應激的能力減弱,而過表達PGC1α可上調上述抗氧化酶的表達,增強抗氧化能力,對動物模型發揮保護作用,提示PGC1α在抗氧化應激方面發揮重要作用。對骨骼肌、弗里德的共濟失調(Friedreich’s ataxia)和糖尿病小鼠模型研究發現,激活AMPK,可上調PGC1α的表達,增強抗氧化能力,對上述動物模型發揮保護作用[5,13-15],提示PGC1α可能是AMPK下游靶蛋白。Guan等[16]研究發現,雷公藤紅素通過激活AMPK上調PGC1α表達,減輕氧化應激,從而對糖尿病大鼠骨骼肌起保護作用,上述研究均提示PGC1α可能成為疾病作用新的靶點。然而激活AMPK能否通過上調PGC1α表達從而對LPS誘導急性肺損傷小鼠發揮保護作用尚未可知。本研究顯示二甲雙胍通過激活AMPK對小鼠急性肺損傷發揮保護作用,這種保護作用伴隨PGC1α表達的上調,提示激活AMPK對LPS誘導小鼠急性肺損傷的保護作用可能與PGC1α上調有關。本研究為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征提供新的治療思路。