重組干擾素γ對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中NLRP3炎癥小體活化的影響

李儒佑,馮六連,柯正華,周 朕,黃永軍,王鋼勝

(鄂東醫療集團黃石市中心醫院,湖北理工學院附屬醫院呼吸內科,黃石 435000;*通訊作者,E-mail:995491185@qq.com)

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是常見和多發的一種非特異性炎癥性疾病,近年來發病率呈上升趨勢[1],在給患者生活質量帶來影響的同時,亦可導致哮喘、鼻竇炎等的發生和進展,從而進一步加劇了患者痛苦[2]。研究表明[3],免疫炎癥反應在AR發病及進展中發揮重要作用。NOD樣受體蛋白結構域3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白凋亡相關點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬酶1(Caspase-1)組成的、存在于細胞內的一種復合體,在促進炎癥反應中發揮重要作用[4],有研究指出[5],NLRP3炎癥小體活化參與了AR發病,且與炎癥反應程度有關。基因重組干擾素作為由人體細胞分泌的蛋白,其中,γ干擾素(IFN-γ)是主要類型之一,在免疫調節及抗炎中發揮重要作用[6]。IFN-γ是否通過影響NLRP3炎癥小體活化而參與AR發病,目前鮮有報道。本研究通過構建大鼠AR模型,并采用鼻腔滴入的方式給予IFN-γ干預,觀察其對大鼠鼻黏膜中NLRP3炎癥小體活化的影響,以期為AR臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組大鼠IFN-γ購自德國RELIATech公司,卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和氫氧化鋁粉劑購自美國Sigma公司,Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司,逆轉錄和PCR擴增試劑購自日本TaKaRa公司,NLRP3、ASC、Caspase-1和內參序列由上海生工生物公司設計合成,兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體購自美國Abcom公司,兔抗大鼠ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗體購自美國SantaCruz公司,鼠白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-8檢測試劑盒購自上海恒遠生化試劑有限公司,鼠OVA特異性IgE(OVA specific IgE,OVA-sIgE)檢測試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠30只,SPF級,體質量240-280 g,8周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證號:SCXK(滬)2017-0005),飼養于標準環境,自由飲水進食,適應性飼養7 d。利用隨機數字表隨機分為對照組、AR組和IFN-γ組,每組10只。

1.3 AR大鼠模型構建

參考文獻[7]中的方法構建AR大鼠模型。基礎致敏:制備含0.3 mg OVA和30 mg氫氧化鋁粉劑的生理鹽水1 ml,對AR組和IFN-γ組大鼠進行腹腔注射,隔日1次,注射7次,對照組大鼠則腹腔注射含30 mg氫氧化鋁粉劑的生理鹽水,用法用量同AR組和IFN-γ組。強化致敏:從第14天開始,AR組和IFN-γ組大鼠分別用含5% OVA的生理鹽水滴鼻,雙側鼻腔各滴100 μl,1次/d,連續7 d。激發AR:強化致敏后,間隔7 d,用50 μl的1% OVA進行激發,連續20 d,均出現AR典型的癥狀和體征,如嗜睡、毛蓬松、活動減少、噴嚏不止并搔抓鼻部、出現鼻流液、覓食改變等,且隨著激發次數增多而癥狀加重。對照組大鼠則以同樣的方法給予等量的生理鹽水。整個建模過程中各組大鼠均無死亡。AR組和IFN-γ組大鼠從激發第1天開始,在給予OVA激發前30 min,分別給予PBS和IFN-γ(濃度為0.02 μg/μl)滴鼻,50 μl/側,1次/d。

1.4 AR大鼠模型評價

各組大鼠于末次激發后30 min內,對大鼠進行行為學評分[8]。流涕:1分,涕流至鼻前孔；2分,超過鼻前孔；3分,涕流到面部;噴嚏:1分,1-3個；2分,4-10個；3分,>10個;搔鼻:1分,輕輕擦鼻2次以內；2分,反復劇烈擦鼻不止。各項得分相加,>5分則提示模型構建成功。

1.5 標本采集

各組大鼠于評價結束后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,用無菌生理鹽水對各組大鼠雙側鼻腔灌洗,收集灌洗液,4 ℃,3 500 r/min離心15 min,取上清,-80 ℃保存;處死各組大鼠,取血液2 ml,3 500 r/min離心10 min,-80 ℃保存;分離大鼠鼻骨前皮膚,去除鼻骨,取雙側鼻腔呼吸區黏膜,立刻置于液氮中,-70 ℃保存。

1.6 實時熒光定量PCR

取雙側鼻腔呼吸區黏膜組織,剪碎研磨,加入細胞裂解液,離心取上清,加入總RNA提取試劑,離心取沉淀,用紫外分光光度計檢測RNA純度,以A260/A280>1.80為合格。用逆轉錄試劑對RNA進行逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板用PCR儀對引物擴增。引物序列:NLRP3:上游5′-CTGCATGCCGTATCTGGTTG-3′,下游5′-GCTGAGCAAGCTAAAGGCTTC-3′;ASC:上游5′-AGACATGGGCATACAGGAGC-3′,下游5′-GCAATGAGTGCTTGCCTGTG-3′;Caspase-1:上游5′-AAGAAGGTGGCGCATTTCCT-3′,下游5′-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3′;GAPDH:上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′,下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。反應條件:92 ℃ 3 min,92 ℃ 30 s,92 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,76 ℃ 30 s,共36個循環,每個樣品設平行復孔6個,用2-ΔΔCt法計算大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量。

1.7 Western blot檢測

取雙側鼻腔呼吸區黏膜組織,剪碎研磨,加入細胞裂解液,離心、提取總蛋白。BCA法檢測濃度,取50 μg總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉移至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂奶粉封閉60 min,加入一抗兔抗大鼠NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20多克隆抗體(稀釋比例為1 ∶800，1 ∶1 000，1 ∶500和1 ∶600),4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，加入二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育120 min，TBST沖洗3次，暗室曝光20 min，拍照，用Image J圖像分析軟件分析對各條帶灰度值分析。

1.8 酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)

利用ELISA法檢測大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度,在標準條件下嚴格按照試劑盒說明完成操作。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 重組IFN-γ滴鼻對AR大鼠癥狀的影響

AR組和IFN-γ組大鼠在激發后均出現了AR癥狀,但IFN-γ組大鼠癥狀較AR組輕,對照組則僅有少數大鼠有抓撓鼻部的表現,未出現其他癥狀;末次激發后30 min內,對照組、AR組和IFN-γ組行為學評分分別為(0.80±0.79)分、(7.80±1.48)分和(5.50±0.71)分,差異有統計學意義(F=146.132,P<0.01),AR組大鼠行為學評分高于對照組,而IFN-γ組大鼠行為學評分低于AR組,差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 重組IFN-γ對鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達的影響

AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均高于對照組,而IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均低于AR組,差異有統計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達(n=10)

Table 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 mRNA in nasal mucosa of rats(n=10)

分組NLRP3 mRNAASC mRNACaspase-1 mRNA對照組1.03±0.141.00±0.061.02±0.07AR組1.86±0.17a1.63±0.14a1.72±0.10aIFN-γ組1.53±0.16ab1.38±0.15ab1.40±0.06ab F69.69366.736216.044 P<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05

2.3 重組IFN-γ對鼻黏膜中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白表達的影響

AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均高于對照組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量低于對照組,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均低于AR組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量高于AR組,差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(n=10)

Table 2 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats(n=10)

分組NLRP3ASCpro-Caspase-1Caspase-1 P20對照組0.25±0.030.19±0.020.68±0.090.18±0.07AR組0.75±0.06a0.79±0.05a0.28±0.050.67±0.07aIFN-γ組0.48±0.04ab0.41±0.05ab0.44±0.050.52±0.08ab F201.910235.18692.14966.428 P<0.01<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05。

圖1 大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達Figure 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 proteins in nasal mucosa of rats

2.4 重組IFN-γ對鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE的影響

AR組大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE濃度均高于對照組,而IFN-γ組大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6水平和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均低于AR組,差異有統計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8水平及血清中OVA-sIgE濃度(n=10,pg/ml)

Table 3 The levels of IL-1β, IL-6 and IL-8 in bilateral nasal lavage fluid and the concentration of OVA-sIgE in serum in each group(n=10,pg/ml)

分組IL-1βIL-6IL-8OVA-sIgE對照組33.17±5.6225.73±5.4433.34±6.49 21.52±5.04AR組85.52±6.73a67.89±6.81109.39±15.68a48.25±6.17aIFN-γ組57.16±7.72ab39.65±5.49 71.37±9.12ab35.64±4.28ab F151.094130.403116.900105.529 P<0.01<0.01<0.01<0.01

與對照組比較,aP<0.05;與AR組比較,bP<0.05

3 討論

AR是由過敏原引起的IgE介導的多種炎癥介質、細胞因子及免疫活性細胞參與的鼻黏膜慢性炎癥,具有發病率高、對人群生活質量影響大的特點[9]。該病病因及發病機制較為復雜,在治療時主要以抗組胺藥及皮質類固醇等為一線治療藥,但這些藥物均會帶來不同程度的不良反應[10]。IFN-γ作為近年來用于免疫調節的藥物,在改善免疫力及抑制炎癥反應中發揮重要作用[11],重組IFN-γ是通過基因工程合成,其生物學活性與人體產生的完全一致[12],同時,該藥無抗組胺藥及皮質類固醇等的不良反應,已被用于肝纖維化[13]及自身免疫性疾病[14]的臨床治療。嚴孝花等[15]指出,重組人IFN-γ治療變應性鼻炎可獲得明顯的近期療效。本研究利用OVA對大鼠全身致敏及局部激發的方法制備AR模型,結果顯示,AR組和IFN-γ組大鼠在激發后均出現了AR癥狀,如嗜睡、毛蓬松、活動減少、噴嚏不斷并搔抓鼻部、出現鼻流液、覓食改變等,且隨著激發次數增多而癥狀加重,且行為學評分均在5分以上,而對照組則僅有少數大鼠有抓撓鼻部的表現,說明成功構建了大鼠AR模型。同時,本研究結果顯示,IFN-γ組大鼠在激發后AR癥狀較AR組輕,且末次激發后30 min內行為學評分低于AR組,說明IFN-γ滴鼻干預可有效減輕大鼠AR癥狀。

炎癥小體是存在于細胞中的多蛋白復合物,在介導機體免疫應答、自發炎癥及自身免疫性疾病發生、進展中發揮重要作用[16],NLRP3炎癥小體是主要的炎癥小體類型,由NLRP3蛋白、ASC和Caspase-1組成,一般情況下,NLRP3蛋白處于抑制狀態,一旦受到外界刺激(如病原微生物、胞內代謝物等)時,NLRP3蛋白便會與配體結合發生結構改變,進而與ASC結合,通過ASC的CARD結構域招募并將Caspase-1激活,而Caspase-1活化則可對無活性的IL-1β、IL-18等前體進行加工活化,從而成為有活性的IL-1β和IL-8炎癥因子,并促進其分泌至胞外發揮炎癥級聯反應[17],亦有研究指出[18],NLRP3炎癥小體激活可促使IL-6分泌增加而促進炎癥反應。IFN-γ可以通過活化誘導型一氧化碳合酶而加速胞內NO合成,而NO可通過誘導NLRP3亞硝基化而阻止炎癥小體的組裝[19]。本研究結果顯示,AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均高于對照組,AR組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均高于對照組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量低于對照組,AR組大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均高于對照組,說明NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應參與了AR發病過程,同時,本研究結果顯示,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相對表達量均低于AR組,IFN-γ組大鼠鼻黏膜中NLRP3、ASC、Caspase-1和Caspase-1 P20蛋白相對表達量均低于AR組,而pro-Caspase-1蛋白相對表達量高于AR組,IFN-γ組大鼠雙側鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-6和IL-8及血清中OVA-sIgE濃度均低于AR組,說明IFN-γ可能通過抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應而減輕AR大鼠癥狀。

綜上所述,重組IFN-γ滴鼻對AR大鼠具有一定的治療效果,可有效減輕AR大鼠癥狀,其機制可能與重組IFN-γ抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應有關,有望為AR臨床應用提供實驗支持。