不同來源血漿評估APTT試劑內源性凝血因子缺乏敏感性的比較研究

袁 莉,王 威,王 剛,王曉琴

(西安交通大學第一附屬醫院檢驗科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:1493722680@qq.com)

活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)是臨床上篩選內源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實驗,同時還可用做普通肝素的治療監測及狼瘡抗凝物的篩選。對常規術前凝血結果的解釋;有出血癥狀的單因子缺乏患者的檢測;以及手術和創傷后的異常出血等均需要了解和評估所使用APTT試劑對內源性凝血因子缺乏的敏感性[1,2]。美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)在2008年就發布了一期法PT和APTT實驗指南(H47-A2)[3],給出了評估APTT試劑因子敏感性的方法。盡管該指南操作簡單易行,但有文獻報道不同來源的乏因子血漿或者不同廠家的乏因子血漿獲得的敏感性結果存在差異[4,5],目前國內尚未見類似報道。因此本研究采用商品化血漿和單因子缺乏患者血漿,分別評估實驗室常規使用APTT試劑的內源性凝血因子缺乏的敏感性,并比較其差異。期望為檢驗結果的合理解釋及臨床干預提供可靠的實驗依據和指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:日本Sysmex CA7000全自動血凝儀;試劑:APTT測定試劑盒(上海太陽生物技術有限公司),接觸激活劑為鞣花酸;磷脂種類為兔腦磷脂,CaCl2濃度為0.025 mmol/L。

1.2 樣本來源

商品化標準血漿、乏Ⅷ因子血漿、乏Ⅸ因子血漿、乏Ⅺ因子血漿、乏Ⅻ血漿均為凍干品,均來自于SIEMENS公司。單因子缺乏的患者血漿來自于西安交通大學第一附屬醫院2016-01～2018-12的臨床檢測樣本共213例,另有10例來自健康人的血漿,單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ缺乏病例分別有109例、58例、14例和22例,樣本無溶血、脂血及黃疸。采用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管,離心分離獲得乏血小板血漿。所有樣本進行四個內源性因子檢測。

1.3 研究方法

凍干標準血漿以及乏因子血漿用無菌注射用水復溶。經CA7000儀器檢測標準血漿及缺乏單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ血漿的因子活性。APTT因子敏感性評估依據CLSI H47-A2指南進行:采用商品化的單因子缺乏血漿與標準血漿按比例配制出不同單因子活性的混合血漿,因子活性范圍在<1%到100%之間,上機進行APTT檢測。同時檢測FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ活性和APTT值。正常參考區間來自于本實驗室:28-43.5 s(120例健康捐獻者新鮮血漿建立)。所有標本均在4 h內完成測定。

1.4 統計學分析

來自商品化的標準血漿和乏因子商品血漿配置的不同因子濃度水平的混合血漿進行APTT測定,所得的APTT值分別與相應的凝血單因子活性擬合非線性回歸曲線,曲線與正常參考區間上限交叉點的百分活度(%)即相應因子的敏感性。來自單因子缺乏的患者血漿直接記錄其所測因子活性和相應APTT值,因子敏感性獲得方法同前。采用extra-sum-of-F檢驗比較兩種方法的最佳擬合非線性回歸方程,分析各數據集得到的方程是否不同。所有數據的統計學處理采用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA,USA)軟件。

2 結果

2.1 商品化標準血漿與乏因子商品血漿內源性凝血因子活性測定結果

標準血漿與4個乏因子血漿FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的因子活性(見表1)。標準血漿的因子活性均在正常參考區間內。乏因子血漿除特定因子活性<1%外,其余因子活性均在正常參考區間內(70%-120%)。

表1 商品化標準血漿及乏因子商品血漿FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的活性(%)

Table 1 Activity of commercialization of standard plasma and FⅧ, FⅨ, FⅨ and FⅫ deficiency plasma(%)

試劑FⅧFⅨFⅪFⅫ標準血漿 101.810991.5101.8乏FⅧ血漿<182.171.284.3乏FⅨ血漿87.4<176.379.1乏FⅪ血漿84.778.2<171.9乏FⅫ血漿92.685.483.4<1

2.2 單因子缺乏患者血漿的內源性凝血因子活性的分布

來自單因子缺乏患者血漿的內源性凝血因子活性分布(見表2)。單因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ缺乏病例分別有109例、58例、14例和22例,重度(<1%)缺乏病例整體比例小,中度(1%-5%)缺乏病例次之,輕型(>5%-40%)因子缺乏比例最高。

表2 來自單因子缺乏患者血漿的內源性凝血因子活性的分布(例)

Table 2 Distribution of endogenous coagulation factor activity in plasma from patients with single factor deficiency(cases)

分組n內源性凝血因子活性<1%1%-5%>5%-40%FⅧ缺乏患者10923770FⅨ缺乏患者5821343FⅪ缺乏患者14248FⅫ缺乏患者220517

2.3 商品化乏因子血漿和單因子缺乏患者血漿評估內源性凝血因子敏感性結果的比較

兩種不同來源血漿評估4個內源性凝血因子敏感性的非線性回歸曲線(見圖1)。圖中虛線結果為來自單因子缺乏的病人血漿,實線結果來自商品化乏因子血漿,并顯示了兩種方法評估結果的非線性回歸系數R2。來自于病人血漿FⅧ活性在<1%-118%之間,FⅨ活性在<1%-115%之間,FⅪ活性在<1%-95%之間,FⅫ活性在<1%-80%之間。

兩種不同來源血漿對內源性因子的評估結果,結果顯示來自單因子缺乏病人血漿的評估結果均明顯低于商品化血漿,其中FⅧ、FⅪ和FⅫ的兩種方法評估結果差異有統計學意義(P<0.05,見表3)。

APTT:活化部分凝血活酶時間(s);CLSI:商品化乏因子血漿評估因子敏感性的方法;patients:患者單因子缺乏血漿評估因子敏感性的方法圖1 不同來源血漿進行內源性凝血因子敏感性評估的非線性回歸曲線Figure 1 Nonlinear regression curves for sensitivity assessment of endogenous coagulation factors in plasma from different sources

表3 商品化乏因子血漿和單因子缺乏患者血漿評估內源性凝血因子敏感性結果比較(%)

Table 3 Comparison of plasma sensitivity of endogenous coagulation factors from commercial and patients plasma with single factor deficiency(%)

血漿來源 FⅧ敏感性FⅨ敏感性FⅪ敏感性FⅫ敏感性商品化乏因子血漿68.2 63.8 66.8 54.8 單因子缺乏病人血漿58.653.034.632.8 F10.980.85399.35810.05 P0.00010.46990.00120.0007

因子敏感性的結果是以超出APTT正常參考區間上限時的百分活度(%)表示

3 討論

APTT是臨床上篩選內源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ及FⅫ缺乏的首選實驗。有出血癥狀的單因子缺乏患者及手術和創傷后的異常出血等均需要了解凝血因子的缺乏程度。輕型血友病A和B是指相應凝血因子FⅧ和FⅨ活性或濃度在5%-40%(IU/dl)之間,在大型手術或創傷后可導致嚴重出血[6]。對于FⅪ缺乏患者,其臨床出血表現不一,甚至某些病人FⅪ在40%的活性時表現為嚴重的出血和凝血酶生成減少[7]。FⅫ活性的減低不會引起明顯的出血現象,研究報道:遺傳性FⅫ缺陷的病人,FⅫ活性為2%,FⅫ抗原<1%時也未見明顯出血[8,9]。因而,凝血因子的準確檢測是臨床診斷及治療的重要依據。美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)指南指出對于FⅧ、FⅨ和FⅪ的敏感性應該在30%-45%之間,過高(大于50%)可導致健康人群的APTT結果出現延長;過低(小于30%)則難以篩查出凝血因子輕度缺乏的的患者[3,10]。而APTT是使用最為廣泛的凝血因子缺乏的篩查實驗,且不同試劑對因子敏感性差異較大[11],因此掌握APTT試劑對內源性凝血因子缺乏的敏感性非常重要,不但能夠幫助實驗室根據需要選擇恰當的試劑[12],而且對于輕度凝血因子缺乏患者的結果解釋和臨床干預能夠提供重要的指導作用。

CLSI H47-A2指南推薦使用商品化的標準血漿和商品乏因子血漿評估APTT試劑的敏感性[3],但有研究表明:不同來源商品化乏因子血漿的評估結果差異有統計學意義,甚至某些因子評估結果間差異高達四倍之多[5]。這一結果表明商品化血漿的基質效應并非是導致差異的主要原因,因為不同乏因子血漿的凝血酶生成實驗結果亦存在差異,且乏因子血漿的凝血酶生成潛力越大其評估因子的敏感性越高[5]。一項分別使用了商品化和病人來源的乏因子血漿進行敏感性評估的研究,其結果顯示病人來源的單因子缺乏血漿的評估結果更高[4]。因此本研究同時采用兩種來源的乏因子血漿進行敏感性評估,發現我室使用的APTT試劑-儀器組合對四個內源性凝血因子缺乏的敏感性均較高,達到了30%以上,甚至FⅧ和FⅨ敏感性在50%以上。當后者活性輕度減低至50%-60%之間時即可表現出APTT延長。但我們的結果顯示商品化乏因子血漿的評估結果高于患者血漿,且兩種方法評估FⅧ、FⅪ和FⅫ敏感性差異有統計意義,而Martinuzzo等[4]的結果表明患者血漿的評估結果更高,比較后發現兩項研究使用了不同廠家的乏因子血漿。這也再次說明使用商品化血漿進行因子敏感性評估并不可靠。本研究與其同樣使用單因子缺乏患者血漿對4個因子評估敏感性的趨勢相似,尤其FⅧ和FⅪ評估結果相近,因為兩者采用了相同的激活劑鞣花酸,而激活劑的種類正是不同APTT試劑引起因子敏感性差異的重要因素[13,14]。總之,我們的研究結果表明采用CLSI指南的商品化血漿對因子敏感評估的結果不可靠。本研究采用來自病人的乏因子血漿進行因子敏感性評估,且乏FⅧ和FⅨ的樣本量是既往國外相似研究[4]的近3倍,能夠更好地反映我們使用的儀器-試劑組合對因子敏感性檢測的真實情況。

本研究存在的不足：一是來自于單因子缺乏患者血漿的評估經歷了近兩年時間,其中包含試劑批號的改變,實驗室內部的一些誤差。依據CNAS-CL02-A001臨床血液學檢驗領域應用說明,APTT試劑更換批號時均需要做試劑更換驗證,采用5份正常樣本新舊批號同時檢測,5份樣本中需滿足80%及以上的相對偏差小于1/2行標,認為批間差異可接受,無需更換參考區間。目前還未發現不同批號間結果存在較大差異。二是FⅧ和FⅪ病例中盡管中輕度缺乏病人比例較高,但是在因子活性為40%左右的樣本僅占據少數,而對于FⅪ和FⅫ,這兩者缺乏的病例較為少見甚至罕見,因此這些均可能造成敏感性評估的不準確。

綜上,商品化血漿和單因子缺乏患者血漿在評估APTT試劑內源性凝血因子敏感性時存在顯著性差異。基于CLSI指南的商品化血漿評估方法易于標準化且簡單易行,缺點是不同商品化試劑評估結果差異較大,結果并不可信。而應用單因子缺乏患者新鮮血漿的評估程序不易短期內收集足量病例,且某一因子活性過高時也可能導致對其他因子缺乏的抵消,評估過程中多個試劑批號的使用、實驗室內部誤差的存在以及輕度單因子缺乏病例相對較少等因素也易造成評估結果的偏倚。因而需要更進一步的分析和研究,為臨床提供更可靠的指導作用。