牛蒡根總黃酮對高尿酸血癥小鼠的影響

王 露，權利娜，趙 博，趙子強

(陜西中醫藥大學 藥學院, 陜西 咸陽 712046)

高尿酸血癥(HUA)[1]是由嘌呤代謝紊亂導致的尿酸[2]排泄減少(或增加)的代謝性疾病。目前,用于治療高尿酸的藥物主要分為抑制尿酸生成[3]、黃嘌呤氧化酶抑制劑[4]和促進腎臟尿酸排泄藥物。但它們對胃腸道和腎臟都有較大的副作用,因此尋找治療高尿酸血癥和其腎損傷的天然藥物[5]具有重要的意義。本實驗采用酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法聯合[6]建立小鼠高尿酸血癥模型[7],觀察牛蒡根總黃酮對HUA小鼠血清肌酐(CREA)、尿素(UR)、尿酸(UA)水平以及小鼠腎臟病理狀態下的影響[8],為牛蒡根防治HUA提供實驗依據。

1 材 料

1.1 實驗動物

昆明種6周齡小鼠,雄性,體重30±2g(西安交通大學醫學部實驗動物中心提供) 合格證號: SCXK(陜)2012-003。

將該實驗中的小鼠保持在濕度為40～70%且溫度為20～24℃的正常環境中。在實驗之前,將小鼠在實驗室中適應環境一周;整個實驗過程中,小鼠均是自由飲水和塊狀鼠飼料。

1.2 藥品及試劑

牛蒡根(陜西康盛堂藥業有限公司,批號140506);酵母浸膏(北京奧博興生物技術有限責任公司,批號20141122);羧甲基纖維素納(天津市天力化學試劑制造有限公司,批號140661-1201406);別嘌醇片(上海信誼萬象藥業股份有限公司,批號20146002);氧嗪酸鉀鹽(上海源葉生物科技有限公司公司,批號20150103);0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司公司,批號20150302);無水乙醇(批號100092683)、二甲苯(批號10023418)、中性樹膠(批號10004160)均為國藥集團化學試劑有限公司。HE染液(批號G1005)、分化液(批號G1005-3)、返藍液(批號G1005-4)均為servicebio產品。肌酐(CREA)檢測試劑盒(批號141016006)、尿酸(UA)檢測試劑盒(批號141215203)、尿素(UREA)檢測試劑盒(批號141316004)是深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司產品。其他未做說明試劑均為國內生產的分析級。

1.3 實驗儀器

電子分析天平(上海佑科儀器有限公司FR2004B)、高速臺式離心機(賽默飛世爾科技公司SORVALL)、全自動生化分析儀(邁瑞醫療國際有限公司BS-330E)、脫水機(武漢俊杰電子有限公司產品JJ-12J)、包埋機(武漢俊杰電子有限公司產品JB-P5)、凍臺(武漢俊杰電子有限公司產品JB-L5)、病理切片機(上海徠卡儀器有限公司RM2016)、組織吊具(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司KD-P)、正置光學顯微鏡成像系統(日本尼康NikonEclipse E100 Nikon DS-U3)。

2 實驗方法

2.1 牛蒡根總黃酮的提取工藝

用石油醚對牛蒡根藥材進行脫脂處理,再用70%乙醇加熱回流提取3h(投料比為1∶8),趁熱過濾,棄去藥渣,抽濾,濾液用旋轉蒸發儀回收乙醇,濃縮至幾乎無醇味時,水浴加熱揮掉剩余水分,冷凍干燥成粗粉[9]。用LS-46D大孔樹脂進行純化,純化后繼續冷凍干燥成粉末待用。以蘆丁為對照品,用紫外可見分光光度計測定對照品的吸光度,得到標準曲線的回歸方程為Y=6.8823X+0.007,最后經過計算得到純化后總黃酮的含量為89.1%。將制備的牛蒡根純化產物[10]和制備好的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液按高、中、低劑量組配置成灌胃藥液[11]。

2.2 造模方法

取小鼠30±2g,72只隨機分為6組,分別為:空白組、模型組、牛蒡根總黃酮高劑量組(560 mg/kg)、牛蒡根總黃酮中劑量組(280 mg/kg)、牛蒡根總黃酮的低劑量組(140mg/kg)、別嘌呤醇片劑組(50 mg/kg)。在實驗室中使實驗小鼠適應環境一周后,給其每天兩次酵母浸膏(30g/kg/d)灌胃給藥,連續13天,于第14天灌胃給藥后再腹腔注射氧嗪酸鉀鹽(200 mg/kg)一次。分別在第1天,第8天,第14天分別稱量動物體重一次。模型組與空白組相比(P<0.05)說明造模成功。在第8天,給藥組和陽性對照組每天下午一次灌胃給藥直至14 天,共給藥7天。高劑量組560 mg/kg給藥(給藥體積0.2 mL/l0g);中劑量組(280 mg/kg),低劑量組(140mg/kg),別嘌醇片劑組50 mg/kg(給藥體積0.2 mL/l0g);空白組和模型組給予相同劑量的蒸餾水。

2.3 檢測方法

2.3.1 小鼠CREA，UR，UA含量的測定 在動物模型建立后第14d,腹腔注射氧嗪酸鉀鹽后1h后,進行摘眼球取血,并在低溫下靜置30 min后,通過以3 000 r/min,半徑5cm低溫離心分離血清,10 min后將分離的血清在自動生化分析儀上測定血清中UREA、CREA和UA的含量,根據制造商提供的說明書和儀器操作方法進行具體的操作。

2.3.2 小鼠腎臟狀態的檢查 小鼠取血后,進行頸脫位處死小鼠,用觀察其腎臟組織變化情況,準備像素好的拍照設備進行記錄。

2.3.3 小鼠腎臟組織切片的觀察 解剖剪解剖小鼠,摘取腎臟,制作病理切片,進行石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片,用顯微鏡觀察腎臟組織切片的變化情況并選取適當的圖像用于照片記錄。

2.4 統計學處理方法

3 實驗結果

3.1 小鼠一般生活狀態觀察

在整個實驗過程中,空白組小鼠飲水進食正常,毛色鮮艷,大便正常,精神狀態良好。模型組從第3天開始進食減少,實驗過程中部分小鼠毛色發暗,在整個實驗過程中出現6%左右的死亡率。與模型組相比,總黃酮高劑量灌胃組和陽性對照組的精神狀態好,而中劑量組和低劑量組之間沒有顯著差異。

3.2 對模型小鼠體質量的影響

各組實驗小鼠模型體質量測試結果,見表1。

表1 對酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法建立HUA模型小鼠體質量的影響Tab.1 Effects of yeast extract and Potassium Oxalate Method on body weight of HUA mice( )

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,ΔP<0.05。

由上表可看出,初始體質量基本無差異,在進行隨機分組中各組體重分布均勻。

當實驗進行一周時,與初始值相比,實驗小鼠體重空白組增長較快,模型組有減重,其他各組體質量有所增加。在實驗進行兩周時,與空白組相比,模型組小鼠體質量顯著減少(P<0.05)。與模型組相比,別嘌醇和高劑量組小鼠的體質量均增加(P<0.05),而中劑量和低劑量組均無明顯差異(先用少量小鼠粗略的摸索中毒劑量或致死劑量,然后用中毒劑量或致死劑量的若干分之作為應用劑量,由于所用總黃酮為抗氧化成分,毒性十分小,結合溶解性,確定其給藥劑量)。

3.3 對模型小鼠血清生化指標的影響

實驗各組小鼠CREA、UR、UA活性水平測試結果,見表2和圖1、圖2、圖3。

表2 對酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法建立的HUA模型小鼠CREA，UR，UA水平的影響Tab.2 Effects of yeast extract and potassium oxalate on CREA, UR and UA levels in HUA model )

注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,ΔP<0.05。

3.4 小鼠腎臟狀態觀察

圖1可以看出,正常組的小鼠腎臟呈現正常腎臟的肉紅色,見圖1(a);模型組腎臟失去正常腎臟的肉紅色,并出現區域性的白色,這可能是由于尿酸在腎臟中沉積引起的改變,見圖1(b);高劑量組顏色上趨于正常組,見圖1(c);陽性對照組顏色較模型組正常,見圖1(d)。

圖1 實驗小鼠腎臟狀態觀察Fig.1 Observation of kidney status in experimental mice

由表2和圖1可以看出,與空白組比較,模型組小鼠的CREA，UR，UA水平均顯著升高(P<0.05),說明酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法聯合建立HUA模型組比,別嘌醇陽性組,牛蒡根總黃酮高劑量組均可顯著降低小鼠CREA，UR，UA水平(P<0.05)。

3.5 小鼠腎組織切片觀察

可以看出圖2(e)空白對照組的腎臟結構正常,無炎性細胞浸潤;在圖2(a)模型組中觀察到腎小管雜亂,淋巴細胞大量聚集,在腎小球周圍出現炎性細胞浸潤;圖2(b)低劑量組可以看到淋巴細胞與模型組相比數量相對減少,但仍存在炎性細胞浸潤現,并且腎小管排布散亂;圖2(c)高劑量組相對模型組炎性細胞明顯減少,基本未見炎性細胞浸潤;圖2(d)別嘌醇片組相對模型組炎性細胞減少,腎小管排列較為整齊。結果表明,牛蒡根總黃酮劑量組的病變較模型組病變程度輕。

圖2 小鼠腎組織病理切片HE染色×200Fig.2 HE staining×200 in pathological sections of kidney of mice

4 討 論

在該實驗研究中,采用管飼的方法[12]來避免由飼料喂養不均勻引起的小鼠酵母浸膏攝入的差異[13]。在預實驗中,每天使用酵母浸膏30 mg/kg,灌胃一次,14天后摘眼球取血,測得血清數值[14],但造模不成功。又進行小鼠HUA模型與酵母浸膏和氧嗪酸鉀聯合誘導[15]HUA模型[16]復制成功,模型組血清UA，UR和CR水平顯著升高[17]。說明該模型可加快小鼠體內尿酸生成。持續灌胃酵母浸膏[18]對小鼠的腎臟有一定的損傷,發現有很多白色的星點,這可能就是尿酸鹽[19]沉積物CR，UR排泄率減慢,這個有待在后續試驗去進一步證實。從病理切片[20]可以發現牛蒡根總黃酮高劑量組相對于模型組病變程度小,從小鼠體重量[21]這個指標也可以看出模型組的小鼠體重量相比初始值減少,而高劑量組的體質量雖然增加緩慢,卻也有不同程度的增加,說明高劑量可以對抗酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法建立的小鼠HUA[22]。在對酵母浸膏和氧嗪酸鉀鹽法[23]建立HUA模型中,本實驗選取中藥有效部位進行針對性研究可以很好地提高牛蒡根在臨床治療UA水平[24],還可以降低CR，UR水平,說明牛蒡根總黃酮通過降低UA代謝途徑中的關鍵酶活性調節UA水平,改善腎臟病理狀態[25]。此前,雖有不少學者證實了有些中藥具有防治高尿酸血癥的功效,但臨床應用中暫沒有某一公開的中藥被開發。本課題組在后續研究中,將進一步探索牛蒡根總黃酮降低HUA的作用機制[26]。因此,牛蒡根藥材對于治療高尿酸血癥具有極大的潛力,但本實驗對于其毒理學研究還需不斷的探究,并進一步深化,從而為開發牛蒡根藥用產品打好一定的基礎。