保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質酶基因的克隆及生物信息學分析

蘇文政 吳家強 馬建軍 黃保華 蔣慧 王可 張玉玉

摘要：為了研究保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質酶基因的結構特征及編碼蛋白的功能，根據GenBank中其基因的DNA序列設計引物，以保加利亞乳桿菌MN株的基因組為DNA模板，利用PCR技術擴增N-乙酰胞壁質酶基因，將其克隆到pMD-19T載體上，進行測序與生物信息學分析。結果表明，MN株N-乙酰胞壁質酶基因序列編碼217個氨基酸，與GenBank中公開的N-乙酰胞壁質酶基因核苷酸序列的同源性為98.8%～100.0%;蛋白質的理論分子質量為24.55 ku，理論等電點為9.83;該蛋白屬于親水性蛋白，二級結構以α-螺旋為主;該蛋白的第16～38位氨基酸殘基組成跨膜區，第56～216位氨基酸殘基組成LYZ2結構域。研究結果為今后探討N-乙酰胞壁質酶基因的生物學功能及其功能改造奠定了基礎。

關鍵詞：保加利亞乳桿菌;N-乙酰胞壁質酶;克隆;生物信息學分析

中圖分類號： S182

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0099-04

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，簡稱LB）是可用于保健食品的益生菌菌種之一，具有維持微生態平衡和胃腸道健康、促進營養物質的消化和吸收、增強免疫功能及抗癌抗腫瘤等重要生理功能[1]。N-乙酰胞壁質酶（N-acetylmuramidase）是LB的關鍵自溶酶，可水解肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸間的β-1，4糖苷鍵，從而破壞細胞壁，引起菌體自溶[2-3]。

自溶現象是菌體在不利條件下維持生存的一種自我保護行為[4-5]。發酵的乳制品不同時，乳酸菌自溶的利弊也不相同[6-7]。在干酪生產中，乳酸菌自溶釋放的蛋白酶、肽酶和脂肪酶將干酪中的蛋白質、多肽和脂肪水解為游離氨基酸、脂肪酸等風味物質，從而促進干酪的成熟，并賦予干酪良好的風味[8]。而在酸奶發酵劑的生產中，乳酸菌自溶制約著菌體的增殖，不利于菌株的高密度培養[6]。因此，調控乳酸菌自溶的發生時間和程度，有利于縮短發酵乳制品和發酵劑的生產周期，改善產品風味，從而提高產品質量。

本研究從LB MN株中克隆了N-乙酰胞壁質酶基因，并綜合應用生物信息學軟件預測該基因編碼蛋白質的相關數據，分析其基因結構及功能，為今后深入開展N-乙酰胞壁質酶的功能改造及LB自溶活性的調控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和載體

德氏乳桿菌保加利亞亞種MN株，由筆者所在實驗室分離、鑒定和保存;pMD19-T克隆載體，購自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

Dream Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ，為美國Thermo公司產品;細菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.3 引物合成

根據GenBank中保加利亞乳桿菌ATCC 11842（NC_008054.1）的基因組序列，應用Primer primer 5.0設計N-乙酰胞壁質酶基因的特異引物，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。上游引物：5′-GGAGCACCATATGATGGCTGGACACAGAAA-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTAATTATCGTACTTATTCAGGTTG-3′。在上、下游引物的5′端分別引入Nde Ⅰ和BamHⅠ 2個酶切位點（分別為CATATG、GGATCC）。該引物擴增具有完整開放閱讀框（ORF）的N-乙酰胞壁質酶基因片段，預計擴增片段長度為676 bp。

1.4 目的基因的擴增與克隆

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取保加利亞乳桿菌MN株的基因組DNA作為PCR模板。PCR反應體系：5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（10 mmol/L），各2 μL上、下游引物（10 μmol/L），3 μL模板DNA，0.25 μL Dream Taq DNA聚合酶，加無菌水至50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34個循環;72 ℃ 延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，將目的片段與pMD19-T載體連接，并轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行培養，提取質粒后進行PCR及雙酶切鑒定，將陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。所有試驗于2017年在山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室完成。

1.5 序列比對分析

利用DNA Star軟件對已經獲得的N-乙酰胞壁質酶基因序列片段進行拼接，并推導其氨基酸序列;運用Megalign程序對MN株及GenBank中已發表的10株保加利亞乳桿菌的該基因序列進行比對分析，運用MEGA 4軟件繪制系統進化樹。

1.6 Mur蛋白的生物信息學分析

用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質氨基酸序列的理化特性;用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質的跨膜區和跨膜方向;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白質的信號肽;用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質的親疏水性;用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質的磷酸化位點;用Hopfield HNN（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）預測蛋白質的二級結構;用Smart（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析預測蛋白質氨基酸序列的保守結構域;用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）預測蛋白質的三級結構。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆與鑒定

以保加利亞乳桿菌MN株基因組DNA為模板，PCR擴增N-乙酰胞壁質酶基因。由圖1可以看出，電泳檢測可見 676 bp大小的條帶，與預期目的基因的片段大小相符。將該基因片段與pMD19-T載體連接并轉化到DH5α感受態細胞中后，提取重組質粒pMD19-T-mur，PCR能擴增出676 bp大小的目的基因片段，雙酶切重組質粒可切出663 bp大小的目的片段和2 692 bp大小的載體片段（圖2），表明克隆的 N-乙酰胞壁質酶基因已成功插入pMD19-T載體中。

2.2 基因序列分析

測序得到的MN株N-乙酰胞壁質酶基因的核苷酸序列見圖3，將該序列與GenBank中10株保加利亞乳桿菌的相應基因序列進行比對分析，結果表明，核苷酸同源性達到 98.8%～100%。用MEGA 4繪制系統進化樹，由圖4可以看出，MN株與CNCM I-1519株、LBVIB27株之間的親緣關系最近。

2.3 MN株N-乙酰胞壁質酶的生物信息學分析

2.3.1 蛋白質的理化特性 用ProtParam針對蛋白質的基本理化特性進行分析，結果顯示，MN株N-乙酰胞壁質酶含有217個氨基酸，分子質量為24 546.17 u，理論等電點（pI值）為9.83;該蛋白質由20種氨基酸組成，其中丙氨酸（Ala）和賴氨酸（Lys）含量最豐富，均達到10.1%;總帶正電荷殘基、帶負電荷殘基數分別是33、16個;不穩定指數為33.04，被分類為穩定蛋白質;脂肪族系數為85.02; 其總平均疏水指數為

-0.461，為親水性蛋白。

2.3.2 蛋白質的跨膜結構分析 用TMHMM 2.0軟件預測N-乙酰胞壁質酶的跨膜結構，結果顯示，該蛋白質由內向外存在1個可能的跨膜螺旋區域（16～38 aa），N端的1～15 aa區域為胞內區，C端的39～217 aa區域為胞外區（圖5）。

2.3.3 蛋白質的信號肽預測 用SignalP 4.1進行N-乙酰胞壁質酶的信號肽預測分析，由圖6可以看出，該蛋白質不包含信號肽。

2.3.4 蛋白質的親疏水性分析 用ProtScale分析N-乙酰胞壁質酶的親疏水性，如圖7所示，該蛋白質氨基酸序列絕大多數為親水性殘基（正值表示疏水，負值表示親水），具有多個高親水性區域，表明該蛋白質為水溶性蛋白。

2.3.5 蛋白質潛在的磷酸化位點分析 用NetPhos進行磷酸化位點分析，由圖8可以看出，N-乙酰胞壁質酶有10個絲氨酸（Ser）、9個蘇氨酸（Thr）、7個酪氨酸（Tyr）位點，可能成為蛋白激酶的磷酸化位點。

2.3.6 蛋白質的二級結構預測 用Hopfield HNN預測 N-乙酰胞壁質酶的二級結構，由圖9可以看出，該蛋白質含有的 α- 螺旋（用h表示）占55.76%，無規則卷曲（用c表示）占32.72%，延伸鏈（用e表示）占11.52%。

2.3.7 蛋白質的保守結構域分析 Smart軟件分析結果顯示，N-乙酰胞壁質酶蛋白質的16～38位氨基酸殘基是跨膜區，56～216位氨基酸殘基是LYZ2結構域（圖10）。

2.3.8 蛋白質的三級結構預測 用Phyre2軟件在線預測 N-乙酰胞壁質酶的三級結構，圖11結果顯示，其序列與c5t1qB模板的同源性最高，基于該模板預測的168個殘基（77%的序列）已被建模，可信度達到100%。

3 討論

乳酸菌的自溶現象普遍存在，大量研究表明，肽聚糖水解酶在菌體自溶中發揮著重要作用[4，9]。不同乳酸菌所含關鍵肽聚糖水解酶的種類存在差異，植物乳桿菌WCFS1和干酪乳桿菌ATCC 27092的關鍵肽聚糖水解酶是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[10-11]，而保加利亞乳桿菌LJJ的關鍵肽聚糖水解酶是N-乙酰胞壁質酶[2]，這2種酶均是細菌中普遍存在的肽聚糖水解酶[12]。

N-乙酰胞壁質酶俗稱溶菌酶，是一種無毒、無害、安全性很高的鹽基水解蛋白酶，已被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等行業[13-15]。該酶專一性地作用于肽聚糖的N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞溶解死亡。目前，已被證實能夠水解肽聚糖的溶菌酶有4類：雞蛋白溶菌酶、鵝蛋白溶菌酶、噬菌體T4溶菌酶和擬內串生孢霉（Chalaropsis）溶菌酶，盡管這4類酶的基因序列差異很大，但它們的三維結構顯示出一些有趣的相似性[12]。

保加利亞乳桿菌N-乙酰胞壁質酶的基因序列與上述酶的基因序列不同。本研究成功克隆了保加利亞乳桿菌MN株的N-乙酰胞壁質酶基因序列，該基因全長654 bp，與其他保加利亞乳桿菌菌株的核苷酸同源性達到98.8%～100.0%。系統進化樹分析結果表明，其與CNCM I-1519株、LBVIB27株之間的親緣關系最近。該基因編碼217個氨基酸，應用生物信息學軟件分析其基因的結構特征及編碼蛋白的功能發現，該蛋白的分子質量為24 546.17 u，理論等電點為9.83;該基因編碼蛋白不包含信號肽，但由內向外存在1個可能的跨膜螺旋區域（16～38 aa）;該基因編碼蛋白具有多個高親水性區域，為水溶性蛋白;該基因編碼蛋白可能存在10個絲氨酸、9個蘇氨酸和7個酪氨酸磷酸化位點;蛋白的二級結構以 α-螺旋為主，且保守域56～216位氨基酸殘基是LYZ2結構域;Phyre2軟件成功模擬出了該蛋白的三級結構，為探索該蛋白的結構和功能奠定了基礎。本研究結果為開展N-乙酰胞壁質酶基因的功能改造和保加利亞乳桿菌自溶活性的改造提供了理論依據。

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