吲達帕胺—β—環糊精包合物的制備、物相鑒定及體外釋放度研究

宋美佳 韓景田 田寶成

摘 要 目的：建立吲達帕胺（IDP）-β-環糊精（β-CD）包合物的含量測定方法并優化其制備工藝，對所制包合物進行物相鑒定及體外釋放度考察。方法：采用紫外分光光度法測定IDP-β-CD包合物中IDP的含量；采用溶液-攪拌法制備IDP-β-CD包合物，以包合率為考察指標，采用正交試驗優化制備工藝；比較不同干燥法對包合率和載藥率的影響；采用紅外光譜分析（IR）法和差式掃描量熱法（DSC）對IDP-β-CD包合物進行物相鑒定；通過體外釋放度試驗考察不同干燥法對IDP-β-CD包合物釋放行為的影響。結果：IDP的檢測質量濃度線性范圍為2.0～14.0 μg/mL（r=0.999 7）；定量限、檢測限分別為0.204、0.067 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于2%；加樣回收率為98.8%～101.8%（RSD=1.10%，n=6）。最優制備工藝為β-CD與IDP摩爾比為3 ∶ 1，包合時間為3 h，攪拌速度為300 r/min；所得包合物的平均包合率為72.81%。IR和DSC分析結果均顯示，IDP與β-CD通過物理作用形成包合物。經噴霧干燥后，IDP-β-CD包合物的包合率為（60.96±0.25）%、載藥率為（4.18±0.12）%；經冷凍干燥后，其包合率為（77.31±0.51）%、載藥率為（5.31±0.27）%。12 h內，IDP 原料藥、IDP-β-CD包合物（分別經冷凍干燥和噴霧干燥制備）的累積釋放度分別為37.2%、42.5%、81.9%；與IDP 原料藥相比，噴霧干燥所得IDP-β-CD包合物的累積釋放度升高更為明顯。結論：所建含量測定方法簡便、準確；優化的包合物制備工藝穩定、可行，成功制得IDP-β-CD包合物，且噴霧干燥法可獲得釋放度更高的包合物。

關鍵詞 吲達帕胺；β-環糊精；包合物；工藝優化；物相鑒定；體外釋放

Study on Preparation Phase Identification and Release Rate in vitro of Inclusion Compound of Indapamide-β-cyclodextrin Inclusion Compound

SONG Meijia，HAN Jingtian，TIAN Baocheng（College of Pharmacy， Binzhou Medical University， Shandong Yantai 264003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of indapamide （IDP）-β-cyclodextrin （β-CD） inclusion compound， optimize the preparation technology， carry out phase identification and in vivo release study of it. METHODS： UV spectrophotometry was used to determine the content of IDP in IDP-β-CD inclusion compound. IDP-β-CD inclusion compound was prepared by the solution-stirring method and the preparation technology was optimized by the orthogonal experiment using inclusion rate as index. The inclusion rate and drug-loading rate were compared between different drying methods. Phase identification of IDP-β-CD inclusion compound was verified by IR and DSC. The cumulative release rate of inclusion compound was tested by in vitro experiment. RESULTS： The linear range of concentration of IDP was 2.0-14.0 μg/mL （r=0.999 7）. The quantitative limit and detection limit were 0.204， 0.067 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 2%. The recoveries range was 98.8%-101.8%（RSD=1.10%，n=6）. The optimum technology conditions were as follows the molar ratio of β-CD to IDP was 3 ∶ 1， the inclusion time was 3 h， and the stirring speed was 300 r/min. Average inclusion rate of IDP-β-CD inclusion compound was 72.81%. IR and DSC analysis showed that IDP and β-CD formed inclusion compound through physical interaction. After spray drying， the inclusion rate and drug-loading rate of IDP-β-CD inclusion compound were （60.96±0.25）% and （4.18±0.12）%. After freeze-drying， the inclusion rate and drug-loading rate of IDP-β-CD inclusion compound were （77.31±0.51）% and （5.31±0.27）%. Accumulative release rates of IDP， IDP-β-CD inclusion compound （by freeze-drying and spray drying） were 37.2%， 42.5% and 81.9% within 12 h， respectively. Compared with IDP raw material， accumulative release rate of IDP-β-CD inclusion compound increased significantly after spray drying. CONCLUSIONS： Established method is simple and accurate. The optimal preparation technology of inclusion compound is stable and feasible. IDP-β-CD inclusion compound is prepared successfully. The inclusion compound prepared by spray drying shows higher release rate.

KEYWORDS Indapamide； β-cyclodextrin； Inclusion compound； Technology optimization； Phase identification； in vitro release rate

吲達帕胺（Indapamide，IDP）為噻嗪類利尿藥（結構見圖1），具有利尿和鈣拮抗作用，是一種長效降壓藥，該藥在發揮降壓作用的同時，對心肌細胞及腎臟也表現出明顯的保護作用[1]。由于IDP在水中溶解度極低，使得其在體內吸收較差、生物利用度較低，因此限制了其相關制劑的開發和應用[2-3]。β-環糊精（β-CD）為常用的包合材料，其水溶性較好且毒性較低，難溶性藥物被其包合后，可使藥物溶解度得以改善、溶出增加、生物利用度增大[4-5]。有研究發現，β-CD包合物不僅可以改善藥物溶出，還可提高藥物穩定性，改善藥物的不良臭味[4-5]。為解決IDP生物利用度低和水溶性差的問題，本研究以β-CD為包合材料制備了IDP-β-CD包合物，通過正交試驗以包合率為指標對處方工藝進行了優化，并對經噴霧干燥和冷凍干燥的IDP-β-CD包合物進行了物相鑒定及體外釋藥考察，旨在為其相關制劑的開發提供參考。

圖1 IDP化學結構

Fig 1 Chemical structure of IDP

1 材料

1.1 儀器

TU-1901型雙光束紫外-可見分光光計，包括光源、單色器、吸收池、檢測器、顯示器（北京普析通用儀器有限公司）；EL204型萬分之一電子天平、TGA/DSC3+型熱重及同步熱分析儀（瑞士Mettler-Toledo公司）；SHZ-82A型恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；YC-015實驗型噴霧干燥機（上海雅程儀器設備有限公司）；FDU- 2110型真空冷凍干燥機（日本EYELA公司）；Spotlight 400/400N型傅里葉變換紅外光譜儀（美國珀金埃爾默儀器有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

IDP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100257-200002，純度：>99%）；IDP原料藥（濟南高華制藥有限公司，批號：201501171，純度：>98%）；β-CD（天津登科化學試劑有限公司，批號：20150923，純度：>98%）；透析袋（截留分子量6 000～8 000 Da，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，上海諾倫生物醫藥技術有限公司，批號：20180311）；無水乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 IDP含量測定

2.1.1 檢測波長的選擇 采用紫外分光光度法[6]測定IDP的含量。取IDP對照品、β-CD各10 mg，分別置于100 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，搖勻，得到對照品溶液、空白溶液。取所制得的IDP-β-CD包合物10 mg，置于100 mL量瓶中，加無水乙醇溶解，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取上述3種溶液各適量，于200～400 nm全波長范圍內進行紫外光譜掃描，結果見圖2。由圖2可知，IDP對照品在242 nm波長處有最大吸收，β-CD在該波長處無吸收，IDP-β-CD包合物在242 nm波長處有最大吸收，空白輔料對測定無干擾，故確定檢測波長為242 nm。

2.1.2 線性關系考察 取“2.1.1”項下對照品溶液適量，加無水乙醇稀釋并定容，制成質量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μg/mL的系列線性工作溶液，以無水乙醇作為空白對照，于242 nm波長處測定吸光度（y）。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得IDP的回歸方程為y= 0.065 8x-0.009 7（r=0.999 7）。結果表明，IDP檢測質量濃度線性范圍為2.0～14.0 μg/mL。

2.1.3 定量限與檢測限考察 取“2.1.1”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，分別按信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結果，IDP的定量限為0.204 μg/mL，檢測限為0.067 μg/mL。

2.1.4 精密度試驗 精密量取“2.1.2”項下系列線性工作溶液（質量濃度為2.0、8.0、14.0 μg/mL）適量，于242 nm波長處連續測定6次吸光度。結果，IDP吸光度的RSD為0.93%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置2、4、8、10、12、24 h時于242 nm波長處測定吸光度。結果，IDP吸光度的RSD為0.89%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取IDP-β-CD包合物適量，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于242 nm波長處測定吸光度并代入回歸方程計算樣品中IDP的含量。結果，IDP的平均含量為2.12 mg，RSD為1.14%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 稱取已知含量的IDP-β-CD包合物50 mg，共6份，置于100 mL量瓶中，加入一定量的IDP對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于242 nm波長處測定吸光度并代入回歸方程計算加樣回收率，結果見表1。

2.1.8 樣品含量測定 取IDP-β-CD包合物適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，于242 nm波長處測定吸光度，平行操作6次，并代入回歸方程計算樣品中IDP的含量。結果，IDP的含量在2.09～2.15 mg范圍內。

2.2 IDP-β-CD包合物的制備

2.2.1 制備方法的確定 ①研磨法[7-8]制備。取β-CD 1.0 g，置于研缽中，加少量水研磨均勻；另取IDP原料藥 0.3 g，加無水乙醇2 mL溶解后，將該溶液緩慢加入研缽中，繼續研磨30 min至糊狀；低溫干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按公式計算包合率：包合率（%）=W包合物中的藥量/W投藥量×100%。結果，IDP-β-CD包合物的包合率為50.22%。②超聲波法[9-10]制備。取β-CD1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加水10 mL溶解；另取IDP 原料藥0.3 g，加無水乙醇2 mL溶解后，將該溶液緩慢加入具塞錐形瓶中，于60 ℃下超聲處理30 min；低溫干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按上述公式計算包合率。結果，IDP-β-CD包合物的包合率為59.93%。③溶液-攪拌法[11-14]制備。取β-CD1.0 g，置于圓底燒瓶中，加水20 mL溶解；另取IDP 原料藥0.3 g，加無水乙醇2 mL溶解后，將該溶液緩慢加入圓底燒瓶中，于60 ℃下攪拌30 min；低溫干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按上述公式計算包合率。結果，IDP-β-CD包合物的包合率為65.51%。

由上述試驗結果可知，溶液-攪拌法制備的IDP- β-CD包合物的包合率最高，故本研究選擇溶液-攪拌法作為制備方法。

2.2.2 制備工藝的優化 以β-CD與IDP摩爾比（A，n/n）、包合時間（B，h）、攪拌速度（C，r/min）為考察因素，以包合率（%）為考察指標，按L9（3）4正交試驗設計進行工藝優化。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

2.3 IDP-β-CD包合物的干燥

2.3.1 噴霧干燥法 按上述最優工藝條件制備IDP- β-CD 包合物，將包合物溶液于60 ℃水浴條件下保溫，并用噴霧干燥機（進口溫度：130 ℃，出口溫度：90 ℃）干燥，然后以少量無水乙醇洗滌未包合的IDP，揮干乙醇，即得白色粉末狀IDP-β-CD包合物。

2.3.2 冷凍干燥法 按上述最優工藝條件制備IDP- β-CD 包合物，將包合物溶液冷卻至室溫，然后置于-80 ℃冰箱中預凍4 h，再采用冷凍干燥機干燥12 h，然后以少量無水乙醇洗滌未包合的IDP，揮干乙醇，即得白色粉末狀IDP-β-CD包合物。

2.4 IDP-β-CD包合物的包合率和載藥率的測定

取“2.3”項下經不同方法干燥制備的IDP-β-CD包合物各100 mg，加無水乙醇適量，超聲處理30 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過；取續濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，加無水乙醇定容。在242 nm波長處測定吸光度并計算包合率和載藥率[載藥率（%）=W包合物中的藥量/W包合物的總質量×100%]，平行操作6次，結果見表6。

2.5 IDP-β-CD包合物的物相鑒定

2.5.1 紅外光譜法（IR） 分別將IDP原料藥、β-CD、IDP與β-CD的物理混合物及IDP-β-CD包合物與溴化鉀混合后壓片，于500～4 000 cm-1范圍內進行IR掃描，結果見圖3。由圖3可知，圖3C中IDP與β-CD的物理混合物的特征峰，為圖3A（IDP原料藥）與圖3B（β-CD）特征峰的疊加，其強度和峰位置與IDP、β-CD基本一致；圖3D與圖3E中IDP-β-CD包合物的特征峰，與圖3A（IDP原料藥）特征峰對比可知，在IDP-β-CD包合物中，IDP各個峰的強度發生改變，分別為3 540 cm-1處的—NH2峰消失，1 642 cm-1處的酰胺Ⅰ帶峰藍移至1 700 cm-1附近且峰形變寬，1 590 cm-1處的苯環C=C伸縮振動峰強度增大。這提示IDP進入了β-CD的疏水腔中并與β-CD發生了相互作用，由于受三維空間的相互匹配性、范德華力、靜電相互作用、疏水作用等因素影響，并未形成新的化學鍵[15]，表明IDP已通過物理作用包合到β-CD中。

2.5.2 差示掃描量熱法（DSC） 分別將IDP原料藥、β-CD、IDP與β-CD的物理混合物及IDP-β-CD包合物進行DSC分析，以空白鋁坩堝作為參比，升溫速度為10 ℃/min，N2流速為20 mL/min，溫度范圍為25～270 ℃[12-13，15]，結果見圖4。由圖4可知，圖4A IDP原料藥曲線的熔點峰為165 ℃；圖4B為β-CD曲線；圖4C為IDP與β-CD的物理混合物曲線，其中明顯可見藥物熔點峰；圖4D、E分別為經冷凍干燥和噴霧干燥的IDP-β-CD包合物曲線，其與圖4B曲線相似，且在165 ℃處未見IDP的熔點峰，表明IDP與β-CD形成了包合物，而非IDP原料中的晶體狀態。

2.6 IDP-β-CD包合物的體外釋放試驗

精密稱取一定量的IDP原料藥、IDP-β-CD包合物（分別經冷凍干燥和噴霧干燥制備），以PBS混懸后置于透析袋內，將透析袋兩端封緊后，放入含有釋放介質（PBS）50 mL的錐形瓶中；將錐形瓶置于恒溫振蕩器上，設置溫度為（37±5）℃、轉速為100 r/min，進行體外釋放試驗。分別于振蕩10、20、40、60、80、100 min和2、4、6、8、10、12 h時吸取錐形瓶內釋放介質5 mL（并立即補充新鮮、等溫PBS 5 mL），經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液適量，于242 nm處測定吸光度并計算累積釋放度，結果見圖5。結果顯示，在12 h內，IDP原料、IDP-β-CD包合物（分別經冷凍干燥和噴霧干燥制備）的累積釋放度分別為37.2%、42.5%、81.9%；與IDP原料藥相比，2種IDP-β-CD包合物的累積釋放度均有提高，但噴霧干燥的IDP-β-CD包合物提高幅度更為明顯，提示包合作用可提高IDP在水中的釋放速率，而噴霧干燥更有利于提高IDP-β-CD的釋放度。

3 討論

本研究以β-CD為包合材料，在單因素試驗的基礎上初步篩選了IDP-β-CD包合物的常用制備方法，確定了以溶液-攪拌法進行制備，并對其工藝進行了優化。IDP-β-CD包合物在水中較IDP原料藥釋放增加，表明包合作用可提高IDP在水中的釋放速率。藥物制劑方法及工藝參數對藥物的溶解、釋放可能產生較大的影響，因此本研究考察了冷凍干燥法和噴霧干燥法對IDP-β-CD包合物體外釋放行為的影響。結果顯示，與IDP 原料藥相比，噴霧干燥法制備的IDP-β-CD包合物具有更高的釋放速率。

IR法主要用于分析含羰基藥物的包合作用，并可根據圖譜中特征峰的降低或者消失以判斷是否發生包合作用；而進行DSC檢測時當藥物被包合后，其結晶程度減弱，以致無法檢測到藥物的吸熱峰，由此來判斷包合作用是否生成[16]。本研究采用IR法和DSC法對IDP- β-CD包合物進行物相鑒定。結果均提示，IDP與β-CD通過物理作用形成了IDP-β-CD包合物。

綜上所述，本研究所建含量測定方法簡便、準確，可用于IDP的含量測定；優化的包合物制備工藝穩定、可行，并成功制得IDP-β-CD包合物，且采用噴霧干燥法可獲得釋放速率更高的包合物。

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（收稿日期：2019-01-08 修回日期：2019-04-21）

（編輯：陳 宏）