豬圓環病毒2型感染現狀和免疫控制

王科文，曹海濤，劉忠行，郭海兵，楊麗梅，姚 晶，盧 悅，陳 萍[碩騰（上海）企業管理有限公司，上海 長寧 200050]

斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）首先發現于1991年的加拿大豬群，以消瘦、黃疸為特征（Clark，1996；Harding，1996），隨后全球都有報道。之后陸續報道與PCV2相關的疾病有豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、繁殖系統疾病、呼吸道疾病和腸炎。所有這些疾病最初都稱之為豬圓環病毒病（PCVD），這個命名在歐洲被廣泛使用，但2006年10月，美國豬獸醫協會（AASV）將其命名為豬圓環病毒相關疾病（PCVAD）。PCV2感染后可以表現為臨床疾病，也可以為亞臨床感染，感染后的損失來自于豬死亡率的增加、藥物治療成本的增加、獸醫成本、生長緩慢豬的額外飼料以及更多的護理人員等。多數情況下，亞臨床感染比臨床疾病導致的經濟損失明顯高（Pablo等，2013）。目前該病是造成全世界養豬生產經濟損失最嚴重的疾病之一。

1 我國豬群PCV2感染現狀

1.1 血清學調查結果

碩騰豬病診斷實驗室對2018年12月份至2019年5月份52家規模化豬場的4 384份血清樣品，用ELISA方法調查了PCV2的抗體。所檢測的所有豬場為PCV2抗體陽性，樣本PCV2抗體總陽性率為61%，所有豬場不同階段PCV2抗體總體陽性率見圖1。通過各階段陽性率可看出，在12周齡時的陽性率中位數/平均值都最低，隨后逐漸上升?？紤]到采樣場大部分在14~21日齡免疫PCV2疫苗，可知生長豬群盡管都在免疫PCV2疫苗，但大部分生長豬群PCV2仍然在12周齡以后循環，雖然觀察到的臨床PCVAD案例不多，但多呈亞臨床感染，和美國豬群類似。

圖1 52個豬場各階段PCV2抗體總體陽性率

1.2 qPCR調查結果

為進一步了解PCV2在豬群循環的階段和強度，選擇了上述血清學調查中的10個場做PCV2循環階段和強度評估，這10個豬場都是在10周齡后PCV2抗體陽性率有明顯上升的。每個場分別取4、10、16、20周齡等4個階段血樣進行qPCR檢測，每階段檢測5份（其中1個場只檢測4份），結果如表1。由表1知，10周齡以后，陽性場數和陽性樣品數都大幅上升，到20周齡時，全部豬場都為PCV2抗原陽性，總體樣本陽性比例也達到33/49。綜合表1和10個場各階段的抗原陽性率及抗原拷貝數變化可知（圖2和圖3），豬場感染PCV2主要發生在10周齡和20周齡之間。

表1 10個豬場在4個周齡段的PCV2 qPCR檢測結果

圖2 10個豬場4個周齡段PCV2抗原陽性率

圖3 10個豬場4個周齡段PCV2拷貝數分布（log10）

由上述PCV2抗體和抗原調查結果可知，PCV2仍然在目前大多數生長豬群12周齡以后循環，少數豬群在保育期，甚至哺乳期階段即存在PCV2感染。

2 免疫控制

2.1 瑞圓安?疫苗簡介

眾多研究表明，PCV2疫苗的免疫可顯著減少PCVAD的發生，減少血清和組織中PCV2載量，減少PCV2的傳播，提高豬群的生產水平。目前常見豬圓環病毒疫苗有PCV2病毒滅活苗、PCV1-2嵌合體病毒滅活苗和PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗。瑞圓安?為全球首創的PCV1-2嵌合體滅活疫苗，由滅活的PCV1-2病毒（圖4）和SLCD水包油佐劑組成。

PCV1-2病毒具有PCV1的良好復制能力，又保留了PCV2中保護性抗原表位的良好空間構像，滅活后具有優秀的免疫原性（滅活劑為BPL，β-丙內酯，常用于狂犬病疫苗的滅活，對病毒既有很強的滅活效果，又能保留病毒很好的免疫原性）。SLCD水包油佐劑通過促進抗原遞呈等多個途徑參與疫苗免疫后的免疫應答，從而進一步提高瑞圓安?的細胞免疫和體液免疫水平，延長免疫保護期。體液免疫在阻止PCV2感染、吸附和侵入細胞起到重要作用；細胞免疫有助于感染細胞的清除和提供長期的保護（甚至中和抗體消失的情況下），保守的T細胞表位的細胞介導免疫能提供廣泛的保護。

圖4 瑞圓安?的抗原—嵌合體PCV1-2病毒

2.2 接種瑞圓安?后的免疫反應

Hwi Won等（2014）通過比較4種PCV2商品化疫苗免疫3周齡PRRSV（藍耳病病毒）、Mhp（肺炎支原體）、PCV2（圓環病毒2型）陰性仔豬的多項免疫指標，揭示了PCV2疫苗免疫后的細胞免疫和體液免疫發展規律。由圖5可知，無論PCV2病毒滅活苗、PCV1-2嵌合體滅活苗，還是亞單位苗，免疫后PCV2特異性 γ-干擾素分泌細胞（IFN-γ-SC）都是在免疫后21天達到最高水平，然后逐漸降低，直到免疫后154天仍能被檢測到。而由圖6知，這3種疫苗免疫后中和抗體都是42天達到高峰（試驗中用的中和病毒屬于PCV2b），能維持到免疫后至少154天。

當然，由圖5和圖6可知，瑞圓安?與另一個全病毒滅活苗IFN-γ-SC和中和抗體最高值都顯著優于其他兩個亞單位疫苗，這可能與全病毒疫苗具有更好的免疫原性有關。

圖5 4種商用疫苗接種后不同時間PCV-2特異性γ-干擾素分泌細胞（IFN-γ-SC）數量的平均值及標準差

圖6 4種商用疫苗接種后不同時間中和抗體水平（NA）均值和標準差

2.3 瑞圓安?的免疫效力

眾多的研究證實瑞圓安?具有優秀的免疫效力。Neill等（2011）比較了瑞圓安?和亞單位PCV2疫苗在5日齡和21日齡時免疫PCV2雙陰豬，然后在49日齡用PPV（細小病毒）、PCV2、PRRSV攻毒后的效果，結果表明，兩個疫苗免疫后都能顯著降低攻毒后病毒血癥、病毒載量和淋巴病變，但瑞圓安?在21天免疫能提供更好的保護（表2、表3）。

表2 不同組別圓環病毒49日齡攻毒后的圓環病毒檢出率和病毒DNA數量

表3 用免疫組化方法測淋巴組織中圓環病毒檢出率和淋巴病變指數

Hwi Won等（2013）研究了PCV2疫苗對公豬的保護效果。試驗把25頭8月齡的純種PCV2、PRRSV抗原抗體陰性公豬分為5組，第1～3組分別免疫瑞圓安?、PCV2滅活苗A和PCV2亞單位苗B，第4、5組注射PBS作對照。免疫后21天第1～4組用3毫升/頭PCV2b攻毒（毒株為SNUVR000463；第5代；含毒量為104.5TCID50/毫升）。然后分別從免疫后ELISA抗體值（圖7）、攻毒后血清和精液中病毒載量的變化（圖8和圖9）等方面對疫苗保護效力進行了評估。結果顯示，在攻毒后第0、7、14、21天免疫組PCV2抗體水平顯著高于未免疫組；攻毒后14、21天免疫瑞圓安?組的血清中病毒載量顯著低于其他免疫組；攻毒后21、28天免疫瑞圓安?組的精液中病毒載量顯著低于其他免疫組。

圖7 3種商用疫苗免疫后不同時間PCV2 ELISA抗體值的變化

圖8 3種商品疫苗攻毒后不同時間血清中PCV2b的DNA載量變化

圖9 3種商品疫苗攻毒后不同時間每毫升精液PCV2b基因拷貝數

Hwi Won（2012）在3個豬場用瑞圓安?做了田間免疫試驗，發現瑞圓安?免疫組日增重顯著高于未免疫組，上市日齡縮短了5～7天，死亡率、淋巴病變、PCV2免疫組化指數也都顯著降低（表4）。

表4 3個豬場免疫組和未免組平均日增重、死亡率、淋巴病變指數和圓環病毒抗原免疫組化指數對比

綜上研究知，瑞圓安?免疫后，PCV2特異性γ-干擾素分泌細胞和中和抗體水平都比其他疫苗要高；實驗室攻毒后，免疫瑞圓安?組血液和精液中病毒載量明顯降低；田間試驗中，對提高日增重、降低死亡率，減少淋巴病變都有顯著效果。

2.4 免疫程序的制定

2.4.1 生長豬免疫程序的制定 對生長豬而言，要制定合理的免疫程序，需綜合考慮母源抗體的影響、疫苗免疫后產生有效免疫力的時間（由上文Hwi Won等的研究可知，PCV2疫苗免疫后細胞介導的免疫21天后達到高峰，體液免疫42天后達到高峰），以及PCV2在豬群中實際循環的大約時間。

多個研究發現母源抗體對仔豬接種PCV2疫苗后的免疫反應有干擾，甚至發現21日齡免疫時的母源抗體滴度和其免疫后28天的抗體滴度呈負相關（Yeonsu等，2014）。Fort等（2009）進一步研究發現，具有母源抗體過氧化酶單層免疫試驗（IPMA）抗體值10.6 log2（或中和抗體NA＞8log2）的豬，能夠完全抵抗口鼻接種105TCID50/毫升（不產生病毒血癥），而低于IPMA 5.5 log2（或NA＜3.9 Log2）則會更易感。該研究同時發現，母源抗體IPMA≥10 log2（或NA≥8.8 log2）看起來會干擾免疫后的體液免疫反應，而IPMA＜8 log2（或NA＜5.5 log2）則不會。考慮到酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和IPMA抗體相關性的研究結果（Pireri等，2014；基于 Synbiotics ELISA 試劑盒，見圖10），為避免母源抗體的干擾，免疫時機可在ELISA母源抗體值在400～650之間進行（基于Synbiotics ELISA試劑盒）。碩騰豬病診斷實驗室在2019年1—3月份期間，對來自不同免疫程序母豬的600頭21日齡仔豬的母源抗體用Synbiotics ELISA試劑盒進行了調查，得到的相應平均母源抗體水平，以及我們根據不同母源抗體水平推薦的生長豬大體免疫時機見表5。

圖10 ELISA抗體值和IPMA滴度的相關性（基于Synbiotics ELISA試劑盒）

表5 不同免疫程序母豬的仔豬調查數量、21日齡平均ELISA抗體滴度和建議大體免疫時機

實際生產中，母豬免疫程序相同的豬場間的母源抗體也有差異。為了解其后代免疫前的母源抗體的真實水平，可在免疫前某個時間點采10～15個血樣，檢測ELISA抗體，然后結合母源抗體的半衰期（大約為15天），來推算免疫前某個時間的大體母源抗體水平。

為進一步優化生長豬的免疫程序，需了解生長豬群中PCV2循環的具體階段和強度。生長豬群中PCV2循環階段和強度可通過在4周齡、8周齡、12周齡、20周齡等4個階段各采15個血清樣本，每3份樣本合成1份樣本進行qPCR檢測。表6為根據各階段qPCR檢測結果優化的免疫程序。

表6 根據PCV2病毒循環時間優化過的推薦接種時間

實際中PCV2感染多發生在5~15周齡，PCV2疫苗接種時間多在1至11周齡進行。免疫日齡最好是母源抗體最小，并在PCV2自然感染之前至少3周。另外，需要提到的是PCV2疫苗免疫2次往往優于1次（Maria等，2008）；在感染PCV2以后免疫PCV2疫苗，接受PCV2攻毒后，仍能顯著降低PCV2的病毒血癥（Shen等，2010）。

2.4.2 種豬免疫程序制定 研究表明PCV2滅活苗免疫母豬以后，其初乳中具有產生PCV2特異性γ-干擾素的T細胞，并能通過小腸進入體內（Goubier等，2009），其后代PCV2特異性γ-干擾素分泌細胞顯著高，攻毒后淋巴病變免疫組也顯著低（Yeonsu等，2012）。進一步的研究表明，免疫母豬的后代的生長性能優于未免疫的后代（Kurmann等，2011），母豬、仔豬都免疫優于其它的免疫程序（Fraile等，2015）。

對于有PCV2感染壓力，特別是在其后代通過上文采樣和qPCR檢測，發現PCV2在8周齡前有循環，以及有PCV2相關繁殖障礙的豬場，母豬群應免疫2~3次/年，1頭份/次。目前PCV2感染背景的情況下，后備母豬應在第1次配種前至少30天完成2次接種（2次間隔1個月，多在22周齡、26周齡各接種1次），1頭份/次。

如2.3中所述，公豬免疫后再接觸PCV2野毒，血清、精液中病毒載量顯著下降。建議公豬群免疫瑞圓安?2~3次/年，1頭份/次。

3 總結

豬圓環病毒廣泛存在，由于豬圓環病毒疫苗的普遍使用，豬圓環病毒病已經很大程度得到控制，但大多數豬場PCV2仍然在生長豬群12周齡以后循環，少數的豬場在保育期甚至哺乳期就感染PCV2。選擇高效、穩定的PCV2疫苗—“瑞圓安?”，綜合考慮母源抗體水平的衰減、免疫后產生免疫力需要的時間以及病毒循環的時間，制定科學的免疫程序是控制PCVAD最簡單可行的方法。