稻米中無機砷檢測關鍵因素研究及方法建立

周明慧 陳 曦 張潔瓊 伍燕湘 王松雪

(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037)

砷(As) 是自然界中普遍存在的非金屬元素，具有多種形態，砷在生物體內的毒性大小與砷賦存的化學形態密切相關，其中，毒性較大的是無機砷(iAs)[1,2]，已被國際癌癥研究機構(IARC)列為I級人類致癌物。大米是我國大部分地區，特別是南方居民一日三餐的主食來源，相比玉米和小麥等其他糧食作物，水稻因其特殊的生長環境具有更強的砷富集能力，研究顯示稻谷中砷主要以無機砷和二甲基砷的形態存在[3]，稻谷消費已成為我國居民對無機砷最主要的暴露途徑[4,5]，因此我國食品安全國家標準早在2005年就對稻米中無機砷進行了限量要求，并于2017年制定了大米中無機砷國際限量標準[6]。鑒于暴露風險與監管要求，大米中無機砷的快速精準檢測技術成為標準制定和方法研究的熱點。

根據文獻報道，對于稻米中砷形態的提取，一般采用加入溶劑并借助一些輔助手段來提取樣品中不同形態的砷，主要的提取試劑可以分為無機試劑、有機試劑和生化酶類[7-9]，常用的提取方法有微波消解、超聲提取、加熱提取和超聲探針提取等[10-13]。Zheng等[14]的研究發現，有機提取劑中的甲醇有利于有機砷的提取，但會降低無機砷的萃取效率。生化酶類可以避免砷形態之間的轉化，同時降低共提取物的干擾，但是成本較高，操作復雜繁瑣，且有的水解酶不易得到。硝酸作為一種常用的無機提取劑，提取效率較高，目前稀酸加熱法廣泛應用于食品中無機砷的提取，同時也是GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》[15]中規定的稻米樣品無機砷測定的試樣提取方法。通過對不同樣品測試發現，使用稀酸加熱法對稻米樣品進行前處理，樣品的粒徑、溫度以及加熱方法，均是影響提取效率的關鍵因素。另外，熱浸提法耗時長，易造成砷化合物形態的轉化和損失，而且過程中的振搖受人為因素影響大。為此，以實際大米樣品為研究對象，對稻米中無機砷的測定的關鍵影響因素進行系統研究，并建立微波消解-LC-AFS聯用方法對稻米中無機砷進行精準檢測，為稻米中無機砷的提取效率和測定效率及精準性以及大米中無機砷的快速精準檢測提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

BAS-100A型液相色譜-原子熒光聯用儀(配有砷空心陰極燈)；Mars微波消解儀；NOVA-2S單模微波消解儀；PRP-X100陰離子交換柱(250×4.1 mm，10 μm，配有保護柱)；H1650型臺式高速離心機；Milli-Q超純水處理系統；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱；Mettler pH計。

砷標準物質：GBW08666亞砷酸根溶液、GBW08667砷酸根溶液、GBW08668一甲基砷溶液、GBW08669二甲基砷溶液、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、氨水(色譜純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀、硝酸、鹽酸(優級純)。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

用0.15 mol/L HNO3溶液分別將4種砷形態溶液標準物質經多次稀釋配制質量濃度分別為2、5、10、20和25 ng/mL的混合標準使用液。

1.2.2 儀器條件

液相色譜條件：流動相為15 mmol/L (NH4)2HPO4，pH=6.0；梯度流速為0～2 min：1 mL/min，2～6 min：0.7 mL/min，6-12 min：1 mL/min；進樣量為100 μL。

原子熒光條件：負高壓：285V；砷燈總電流：80 mA；主電流/輔助電流：40/40；載流：15% HCl溶液；還原劑：2% KBH4+0.5%KOH溶液；載氣流速：500 mL/min；輔助氣流速：1 000 mL/min；原子化器溫度：200 ℃。

1.2.3 樣品前處理

稱取經研磨后粒徑為0.38 mm的大米粉樣品0.5 g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入7.5 mL 0.15 mol/L HNO3溶液，微波消解程序如表1所示。待提取液冷卻至室溫后于8 000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm有機系濾膜過濾后進樣測定。

表1 微波消解輔助提取程序

2 結果與討論

2.1 大米中無機砷檢測的影響因素

2.1.1 樣品粒徑的控制

樣品粒徑決定其表面積大小，樣品與提取液的接觸面積越大，越有利于無機砷的提取[16]，可見樣品粒徑對于提取效率至關重要。以GB 5009.11—2014的提取方法對不同粒徑樣品進行前處理，提取液的測試結果由圖1可見，不論是糙米還是大米，隨著樣品粒徑增大，無機砷的檢測結果逐漸降低，由此可知，該方法并不能對粒徑大于0.15 mm的樣品進行有效提取，同樣的結果在對不同粒徑的標準物質進行測試中也可進一步被證明(表2)，粒徑較大的GBW(E)080684a可測砷形態的總和明顯低于總砷的定值。一般規格的研磨儀僅能將大米樣品粉碎至粒徑為0.25 mm，要將樣品粉碎至粒徑小于0.25 mm較難實現，所以，需要選擇更為高效的前處理方式。

圖1 樣品粒徑對無機砷檢測結果的影響

2.1.2 前處理方法的選擇

本研究采用粒徑為0.15 mm的大米粉樣品，分別考察了振蕩、超聲和微波等常見輔助提取方式對于稻米中不同砷形態提取效果的影響，結果如圖2所示。圖2中揭示的稻米樣品中存在的3種主要的砷形態中，AsⅢ最難被提取，同時進一步說明尋找更為有效的提取方式的必要性。室溫條件下，振蕩0.5～2.5 h均不能有效地提取樣品中的AsⅢ。同時，在60 ℃條件下，超聲輔助提取2.5 h不能完全將樣品中的無機砷提取出來。而微波輔助提取可在短時間內提取細粒徑的標準物質中的無機砷，相比其他方式具有明顯的優勢，這也是國際上廣泛采用的無機砷測定樣品前處理方法[17-19]。

表2 GB 5009.11—2014方法對于標準物質的提取率

圖2 不同前處理方法對不同砷形態提取效率的影響

2.1.3 溫度對于提取的影響

提取溫度對于無機砷的精準測定至關重要，既要完全提取稻米中的無機砷，又要保證樣品中的砷形態不發生改變。借助可精準穩定控溫的單模微波消解技術，考察標準溶液和樣品中的無機砷在不同提取溫度下的穩定性，結果如圖3所示。溫度在低于110 ℃時，圖3a中AsⅢ的提取效率上升較為明顯，溫度達到110 ℃后，提取率隨溫度升高呈現緩慢上升趨勢；而圖3b中AsV則隨溫度的提高沒有明顯變化，但可觀察到在高溫范圍內有緩慢的下降趨勢，初步推論2種不同價態的無機砷在高溫下有微量的轉化[20]；圖3c則證實了該推斷，溫度達到110 ℃后，無機砷總量無明顯變化，并且不同砷形態加和與總砷定值或者測定結果一致，證實此溫度下無機砷被有效提取出來，由標準溶液測試結果可知，無機砷并未向有機砷轉換，而實際樣品測試結果也顯示，有機砷形態也并未向無機砷形態發生轉換。

2.1.4 微波輔助提取升溫條件的影響

以測定的粗粒徑樣品中不同砷形態結果之和與總砷定值進行對比，選擇微波輔助提取升溫方式，如圖4所示。采用110 ℃，30 min的非梯度升溫方式，樣品中總砷提取結果明顯低于定值，而采用如表1所示的梯度升溫方式進行微波輔助提取，由于在低溫條件下，樣品可與提取試劑充分混合，提高了高溫環節的提取效率，可實現不同粒徑樣品中不同砷形態在30 min被完全提取。

圖4 升溫程序對于提取效率的影響

2.1.5 提取液酸度對于測定的影響

GB 5009.11—2014中規定不同砷形態標準溶液以純水配制，本研究重復了該方法對于不同砷形態組分的完全分離，如圖5所示；而樣品中無機砷使用酸度較大的0.15 mol/L的HNO3溶液進行提取，會對色譜柱內環境pH產生影響，尤其是對于LC-AFS法[21,22]，由于進樣量多達100 μL，影響更加明顯，而陰離子交換柱的分離效果受pH影響較大，從而導致AsⅢ和DMA無法完全分離，見圖6。

圖5 純水配制標準溶液的砷形態分離譜圖(10 ng/mL)

圖6 0.15 mol/L HNO3溶液提取大米樣品的砷形態分離譜圖

為解決大米樣品提取液酸度對色譜分離帶來的影響，根據不同砷形態分離的需求調整國標中恒定流速為1.2.2所述梯度流速，在保證AsⅢ和DMA能得到完全分離的情況下檢測時間不會延長過多，符合批量樣品檢測需求(圖7)。

圖7 10 ng/mL混合標準溶液的梯度流速洗脫色譜圖(磷酸二氫銨)

2.1.6 流動相的選擇

梯度流速下無機砷的測定需要14 min(圖7)，同時待測物AsV的峰面積響應較低，為進一步提升檢測效率和靈敏度，在相同的pH和梯度流速條件下，本研究優化出15 mmol/L(NH4)2HPO4作為流動相，縮短檢測時間至10 min且顯著增加了AsV的峰面積(圖8)。

圖8 10 ng/mL混合標準溶液的梯度流速洗脫色譜圖(磷酸氫二銨)

2.2 方法學評價

基于對稻米中無機砷分析關鍵影響因素的分析和控制，優化建立了微波輔助提取-LC-AFS測定大米中無機砷的方法。

2.2.1 線性方程和檢出限

以LC-AFS色譜峰信噪比S/N為3:1時所對應的濃度計算方法檢出限，同時在2～25 μg/L范圍內對標準曲線的線性相關系數進行考察。如表3所示，2種無機砷形態標準系列線性關系良好，檢出限滿足檢測需求。

表3 線性關系和檢出限

2.2.2 準確度和精密度

為了進一步考察本方法的準確性，采用不同粒徑的標準物質及實際樣品進行測定，如表4所示。所測樣品中不同砷形態結果加和與總砷的標準值全部一致。

表4 方法準確度/mg/kg

選取GBW(E)080684a大米粉成分分析標準物質，平行測定6次，無機砷的相對標準偏差為2.25%，方法精密度良好。

3 結論

對稻米粒徑、提取溫度、提取方式以及液相分離條件進行優化，建立了微波消解-液相色譜-原子熒光光譜聯用方法精準快速測定稻米中的無機砷，從前處理和檢測兩個方面提高粗粒徑樣品中無機砷的檢測效率和檢測精準性。AsШ和AsⅤ的方法檢出限分別為0.026和0.047 ng/mL，滿足GB 2762—2017《食品中污染物限量》中規定稻谷、糙米和大米中無機砷限量為0.2 mg/kg的要求，同時可快速并準確分析待測樣品，適用于批量大米樣品無機砷的測定。