氣相-離子遷移譜聯用技術評定大米霉變程度的應用研究

谷 航 陳 通 陳明杰 陸道禮 陳 斌

(江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013)

稻谷作為第二大谷物，全國有超過65%的人口把它作為主食，政府機構每年都需要儲備大量大米以保障糧食供給安全，穩定調節市場平衡，應對自然災害和突發事件，保證社會穩定[1]。大米在儲藏過程中易受霉菌的侵染，使其品質發生劣變，同時霉菌的次級代謝產物對人畜健康危害極大，若能在霉變早期發現并及時處理，將大大降低大米霉變導致的經濟損失[2-3]。

霉變的常規理化分析方法具有操作步驟復雜、耗時長、靈敏度差等缺點，無法實現快速、無損的檢測需求。隨著色譜、光譜技術的不斷發展，糧食行業對霉變的辨別開始轉向針對霉菌生長代謝產生的物質，如霉菌毒素、霉變揮發性有機物(Microbial Volatile Organic Compounds,MVOCs)的檢測[4]。目前檢測霉菌毒素常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜、液相色譜-質譜聯用技術、酶聯免疫技術等[5-7]。這些方法大都需要樣品經過復雜的前處理，操作繁雜、耗時久[8]。微生物揮發性有機化合物(MVOCs)指的是細菌和真菌在生長繁殖的過程中產生的初級或次級代謝揮發性化合物，被認為是微生物生長的評價指標，在臨床診斷和環境監測中被廣泛應用，近年正逐漸成為研究微生物污染的新型有效手段[9-10]。

氣相色譜與離子遷移譜聯用技術(GC-IMS)是近年來新出現的一種技術，相比電子鼻與氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)，GC-IMS在揮發性有機物痕量檢測方面顯露出裝置簡單便攜、高靈敏度、無須樣品處理等的優勢[11]。目前該技術用于食品方面的應用研究主要集中在食用油、蜂蜜、茶葉的質量評估等方面，而在大米霉變預測領域研究相對較少[12-15]。

本研究采用GC-IMS技術對霉變大米在不同霉變階段產生的特征性揮發性氣味物質進行檢測分析，遴選出用于表征霉變過程的特征指紋譜，并采用主成分分析(PCA)降維，通過聚類分析探討GC-IMS技術用于大米霉變程度的快速評定方法和進行早期預警的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

散裝清峰大米(鎮江丹陽):市售。3種霉菌：黑曲霉(A)、變幻青霉(B)、寄生曲霉(C)均從霉變大米上篩選鑒定獲得。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec 1H1-00053型氣相色譜-離子遷移譜(配CTC CombiPAL自動頂空進樣裝置)；CLOT毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm)。

1.3 方法

1.3.1 人工霉變樣品的制備

將前期篩選鑒定過的黑曲霉、變幻青霉和寄生曲霉3種霉菌分別制備成孢子懸浮液，濃度為107～108CFU/mL。取1mL孢子懸浮液均勻噴灑至5g大米上，放入恒溫恒濕培養箱(35 ℃、90%RH)中進行培養，每隔4 h取樣檢測1次，以正常大米作為空白樣本，共25個樣本。

1.3.2 自然霉變樣品的制備

大米在儲藏期間容易受到霉菌的侵染，當溫度在25～40 ℃時，黃綠青霉、黃曲霉、灰綠曲霉等開始活動，導致大米霉變[16]。研究選用了江蘇本地大米作為研究對象，含水率控制在14.03%左右。通過預實驗發現10 g大米在恒溫恒濕培養箱中(35 ℃、90%RH)放置3個月后霉變明顯，而最初開始的1個月基本沒有變化[17]。因此對實驗樣本的制備進行了優化，前期集中放樣，逐步拉長放樣時間，當最開始的大米發生霉變即可停止放樣，集中進行檢測，具體的實驗過程為：每次稱取本地大米10 g置于直徑60 mm培養皿中，標上日期放入恒溫恒濕培養箱中(35 ℃、90%RH)，剩下的大米密封放入冰箱保存。從6月11日起開始制備樣本，前20 d連續放樣，然后每隔2、3、5、7、12 d放樣1次，各持續2次，當最早放置的大米表面失去光澤、變黃，出現“起眼”、“起筋”現象且有明顯霉味時停止放樣，最后將放入冰箱保藏的大米作為對比樣本，共制備31個不同存放期的大米樣本并集中在同一時間內集中檢測。

1.3.3 GC-IMS檢測條件優化

本實驗以霉變大米為樣品進行參數優化，分析一些主要特征峰的峰強來選擇最優的實驗條件。每個樣品稱取5 g于20 mL的頂空樣品瓶中，標記后放入自動進樣器的樣品槽中，設置儀器的相關參數后，即可開始檢測。

經參閱資料發現對于不同實驗，色譜柱與漂移管溫度的變化對出峰信息量影響不大。因此，本實驗主要對孵化溫度、孵化時間、進樣量、漂移氣和載氣的流量等參數進行優化。在優化某參數時，其他參數保持不變。

1.3.3.1 孵化溫度的選擇

參考已有的研究結果并考慮到孵化溫度不能超過進樣針溫度(80 ℃)，將孵化溫度的優化區間定為40～70 ℃。由實驗結果可知隨著溫度的上升，特征峰的強度都逐步增加，在60 ℃時達到頂峰；當溫度上升到70 ℃色譜峰強度反而下降，主要原因為溫度過高可能會導致某些化合物熱分解。因此，最終選取60 ℃為最優的孵化溫度。

1.3.3.2 孵化時間的選擇

在孵化溫度60 ℃條件下，分別將孵化時間設置為5、10、15 min后，進行GC-IMS分析，結果發現，與孵化5 min相比，孵化10 min得到的特征峰的強度有所增加，當孵化時間增加到15 min時，峰強基本不變，說明該時間點頂空氣體成分已經達到了平衡點，不會再有新的揮發性物質產生。因此，選取10 min為本研究最優的孵化時間。

1.3.3.3 進樣量的選擇

本研究所用儀器默認進樣量參數值為0.2 mL，考慮到樣本為固體，并參考已有的相關文獻報道，設置進樣量的優化區間分別為：0.2、0.5、0.8、1 mL。隨著進樣量的增加，特征峰的強度逐漸增加，但是由于儀器的檢測上限過低，當進樣量到達0.8mL時儀器開始出現過飽和現象，因此，最佳的進樣量為0.5 mL。

1.3.3.4 漂移氣和載氣流量的選擇

經查閱相關文獻，漂移氣流量的增加對峰值強度基本沒有影響，因此，采用儀器的默認流量：150 mL/min。載氣流量的大小和穩定性對色譜峰的分離有很大影響，GC-IMS聯用儀可以在分析過程中按一定速率提高流量，通過預實驗發現，相比較于恒定流速，程序控流能夠獲得更好的分離效果，因此本實驗采用程序控流，具體程序設置參照表1。

表1 儀器參數條件

1.3.4 特征峰選取

樣品的GC-IMS三維譜特征峰選取原則：GC-IMS三維譜中每個特征峰代表1種揮發性有機成分，以樣品的特征峰有無或者特征峰強度變化為原則，手動選擇并以長方形標記特征峰所在區域，以該特征峰區域的峰高值(即特征區域離子強度的最大值)作為參數變量進行數據分析。

1.3.5 數據分析處理

GC-IMS在正離子模式下采集的三維譜數據傳輸并保存到計算機中，每張譜圖平均掃描32次，使用網格脈沖寬度為100 μs，重復率為21 ms，采樣頻率為150 kHz。

軟件采用 LAV2.2.1和Matlab R20R2009b進行數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 霉變大米GC-IMS譜圖分析

在GC-IMS圖譜中，不同的揮發性有機化合物在圖譜中響應信號的位置不同。在設備檢測范圍內，揮發性有機化合物的濃度越高，在圖譜中的信號響應越強。依據特征峰選取原則，將選取的不同有機揮發性物質對應的特征峰區域進行排序對照，結果如圖所示。圖1為分別被3種不同霉菌感染的大米的檢測結果。

由圖1可知，雖然接種的霉菌種類不同，但是所對應的特征峰的變化趨勢整體一致，如標識號1的特征峰的強度與儲存時間成正比，6號特征峰強度先增加后減少，其他特征峰的強度則隨著儲存時間的增加呈現不同程度減弱的趨勢。通過譜庫檢索數據庫知1號特征峰為1-辛烯-3-醇、6號特征峰為正己酸的出峰，而這兩者都是霉菌產生的特征揮發性有機化合物[18]，而其他物質可能是大米自身特有的氣味，隨著時間的延長濃度被逐步稀釋。選取出的部分特征峰譜庫檢索結果如表2所示。

注：橫坐標“1～21”代表選取的特征峰標示號，縱坐標標示號中A、B、C分別代表黑曲霉、變幻青霉、寄生曲霉，后綴表示培養時間序列。圖1 接種不同霉菌的大米在不同培養時間下所對應的特征峰的圖片庫

注：橫坐標0～84 d代表樣品的存放時間，隨著存放時間變長，霉變程度也增加，縱坐標“1～21”代表選取的特征峰標識號，該特征峰位置信息與圖1選取的特征峰相同。圖2 不同存放時間的大米對應不同特征峰的圖片庫

表2 部分特征峰對應的化合物名稱

圖2是不同存放時間的大米對應不同特征峰的圖片庫。結合圖1與圖2可發現，正常大米樣品隨著存放時間的增加，1號特征峰強度也呈增加的趨勢，表明霉菌生長代謝產生的1-辛烯-3醇濃度逐步增加；6號特征峰強度先增加后減少，與圖1結果一致；而其他特征峰的強度逐步降低，表明大米自身的某些香氣物質逐漸消失(如：庚醛、己醛[19])。隨著霉變程度的增加，營養物質的流失，樣本圖譜上特征峰的數量驟減，僅存在霉變產物所對應的特征峰。通過對原始圖譜中不同特征峰進行簡單的排列比較，可以初步將自然霉變的大米樣本擬劃分為4個時期：正常大米、霉變早期、霉變中期、霉變后期[20]。

2.2 PCA分析

通過選取的不同特征區域的特征峰的組合對比排序大致可對霉變程度進行劃分，但該劃分方法仍受限于觀察者的主觀性，無法實現劃分方法的數字化表達。因此，需結合化學計量學方法進一步分析。以選取的特征峰對應的峰強度值為特征參數變量，采用主成分分析PCA進行降維分析。

圖3為使用PCA分析得到的第一、二主成分圖與載荷圖得分圖描述的是樣本的線性投影，代表了數據方差的主要部分[21]。結果表明，第一主成分和第二主成分的累計貢獻率之和達95%以上，說明第一主成分、第二主成分可以表征選取的特征峰的絕大部分信息。由圖3可知，不同霉變時期的大米樣品均有其自己的歸屬區域，表明PCA方法可以有效將大米的霉變程度進行有效的區分。圖中霉變中期與后期相隔較近的主要原因是樣品間的放樣時間僅間隔1 d，存在一定的檢測誤差。圖3中存放74 d的樣品被劃分在霉變后期，屬于異常值，可能產生的原因是樣品本身帶菌量較高。

注：數字代表樣本的編號。圖3 大米樣本的主成分得分與載荷圖

數據的主成分載荷圖顯示了特征在主成分上的投影，可用于研究特征的相關性和重要程度。其中載荷圖中相應主成分的載荷大小反映了建立模型時特征的重要性，離原點坐標越近，特征的重要性越低。由圖3可知編號為1、4、6、7、11、13、18對應的特征峰離原點較遠，是樣品的重要表征參數。兩載荷向量的夾角是特征間相關性的描述，夾角越小，表明兩個特征之間相關性越高，即可用一個特征來表示。圖3中的1號與6號特征峰、13號與14號特征峰以及其他夾角較小的特征峰，它們之間具有較高的相關性。1與16號特征峰是逆相關的，而它們與2號特征峰相互正交，說明非相關，同理可以分析其他特征峰的相關性。載荷圖表明，前期對特征峰的選取可能不夠具有代表性，某些特征峰存在的意義不大，另一方面也可能是正常大米和早期霉變樣品品質差異不明顯導致區分不明顯。選取具有代表性的特征峰主要是：1、4、7、10、11、13、17、19和21號峰。其對應的物質分別為：1-辛烯-3-醇、丁酸乙酯、葉醇、糠醇、正戊醇、戊醛，這些物質可以作為判斷大米霉變程度的標志性物質。圖3中樣本與載荷向量的接近程度反映了該特征在建立主成分模型中的重要程度，而載荷向量的方向能有效地判斷特征的區分能力。如1、4與13號特征峰可以對霉變早期大米與霉變中后期大米進行明顯的區分，但是正常大米與霉變早期大米間的特征變量離坐標系原點較近，且特征兩兩之間夾角較小，相關性較高，重要程度較低，不能進行較好的區分，霉變中期與霉變后期間特征變量較少，但僅存的兩個特征編號1和6能夠進行一定的區分，但仍然存在歸屬區域不明確的現象。因此，需要進一步采用化學計量學方法建立模型進行判斷識別。

2.3 聚類分析

聚類分析屬于無監督模式識別，即數據沒有類別標記，通過某種算法(如歐氏距離)將數據歸為不同的類，基本原則是要相近的數據盡量歸為一類，而不同類之間的數據則要盡量有比較大的差別[22]。聚類算法有很多種，K-Means 是聚類算法中最常用的一種，要在聚類前指定分成的類別數。本研究采用K-Means算法將經過PCA降維處理過的數據分為4大類：正常大米、霉變早期、霉變中期、霉變后期，結果如圖4所示。

圖4 樣本系統聚類分析結果

由圖4可知，存放74 d的樣品歸屬為霉變后期大米，雖然按放樣時間估計屬于霉變中期，但是其本身霉變程度達到后期，結合GC-IMS圖譜中也可以發現存放74 d的樣品的特征峰與霉變中期的大米的特征峰強度不一致，因此被判斷為霉變后期。由此可知，GC-IMS聯用技術結合化學計量學方法可以快速區分大米存儲過程中霉變過程。

3 結論

實驗采用GC-IMS技術研究了大米霉變過程中產生的揮發性有機成分的變化規律，結合人工接種霉變大米的譜圖庫對自然霉變大米的霉變程度進行了判別，初步構建了霉變大米的GC-IMS指紋圖譜。運用化學計量學方法對其進行了聚類分析，結果表明通過GC-IMS聯用技術依據大米中揮發性有機化合物可以對霉變進行有效的區分。得出利用GC-IMS聯用技術可用于大米霉變過程的快速鑒定與早期預警是可行的結論。