高效液相色譜法測定發酵液中的柔紅霉素含量

秦建萍

柔紅霉素是治療急性白血病的強效蒽環類抗腫瘤抗生素。在柔紅霉素發酵液中存在大量發酵雜質和一些結構十分相似的蒽環類化合物，對其進行分離和鑒定對柔紅霉素的生產具有重要的指導意義。

1 儀器和試藥

Shimadzu高效液相色譜儀及相應的化學工作站;GB-204型電子分析天平;KQ-5200DE數控型超聲波清洗儀;柔紅霉素對照品;柔紅酮、雙氫柔紅酮、雙氫柔紅霉素、柔紅霉素B、阿霉酮和阿霉素對照品;甲醇為色譜純，草酸、碳酸氫鈉、氯仿、無水硫酸鈉、磷酸二氫銨和冰醋酸為分析純，超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil-C18柱;流動相：甲醇-0.01摩爾/升磷酸二氫銨溶液-冰醋酸（62∶38∶0.2），流速：1.0毫升/分鐘;柱溫：30℃;檢測波長：233納米;進樣量20微升。

2.2 樣品的處理

對照品溶液的制備：精密稱取柔紅霉素對照品10.12毫克（91.0%），置50毫升容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得202.4微克/毫升的柔紅霉素對照品貯備液，于4℃冰箱保存備用。

發酵液的預處理：取柔紅霉素發酵液100毫升加入草酸3克，50℃加熱1小時后冷卻離心，吸取上清液4毫升加純化水6毫升和6.6%碳酸氫鈉溶液10毫升，混勻后加入2毫升氯仿，振搖，分取氯仿層加無水硫酸鈉脫水后濃縮至干，加甲醇溶解后進行HPLC分析。

2.3 方法學驗證

線性關系：分別精密吸取柔紅霉素對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.00毫升于10毫升量瓶中，加甲醇溶解，配制成2.024、4.048、8.096、16.192、20.24微克/毫升的溶液。按上述色譜條件分別進樣20微升，以峰面積（A）對對照品質量濃度C（微克/毫升）進行線性回歸，回歸方程：

A=156.98C+2.911（r=0.9995）。

加樣回收試驗：為驗證方法的可靠性，在已測定含量的發酵液中加入不同量的柔紅霉素標準品，由測得結果計算回收率，結果見表1，平均回收率為99.93%，RSD為1.89%。

3 結論

本文以甲醇-0.01摩爾/升磷酸二氫銨溶液（pH4.5）-冰醋酸（62∶38∶0.2）為流動相時柔紅霉素峰形良好，分離度高。筆者采用柔紅霉素發酵液酸化后萃取法除去干擾雜質后測定發酵液中柔紅霉素含量的高效液相色譜法，為進一步研究奠定基礎。