實(shí)驗(yàn)感染沙門氏菌雛雞腸黏膜的電鏡觀察

于欽磊 常帥

為了進(jìn)一步研究沙門氏菌感染雛雞之后對(duì)腸黏膜造成的影響，選用致病性沙門氏菌，通過(guò)口腔接種和卵黃接種感染1日齡的雛雞，接種之后，使用掃描電鏡和透視電鏡對(duì)雛雞腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，腸黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察微絨毛顯著下降、缺損和消失，黏膜表面不平整。沙門氏菌是一種可以感染多種動(dòng)物的條件性致病菌，其中對(duì)禽類動(dòng)物尤其是雞造成的危害最為嚴(yán)重，致病菌主要侵害雞的腸道，常常會(huì)引起胃腸道炎癥，敗血癥等多種病理學(xué)變化。該種致病菌從小腸黏膜表面侵入，經(jīng)淋巴和血液循環(huán)擴(kuò)散到全身，并在肝臟組織或脾臟組織表面形成壞死病灶。目前，有大量研究結(jié)果表明，沙門氏菌具有對(duì)腸黏膜吸附侵入，并在該處繁殖，抗吞噬細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒素和腸毒素的能力，導(dǎo)致宿主出現(xiàn)一系列的臨床癥狀，尤其是出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉癥狀。為了進(jìn)一步研究沙門氏菌對(duì)雛雞腸黏膜造成的影響，本次采用了人工感染模式，從某養(yǎng)殖場(chǎng)分離出致病性沙門氏菌，通過(guò)電鏡觀察，證明沙門氏菌會(huì)對(duì)雛雞腸黏膜造成影響。

1、實(shí)驗(yàn)材料與方法

①試驗(yàn)材料選取

本次研究所選擇的沙門氏菌是從某養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到的具有致病性的沙門氏菌。SPF試驗(yàn)雞來(lái)自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。電子顯微鏡主要為掃描型的電子顯微鏡和透視型的電子顯微鏡，上述兩種電子顯微鏡的電壓分別為25KV和75KV。

②實(shí)驗(yàn)方法

首先，通過(guò)透視電鏡觀察雛雞腸黏膜。將分離得到的菌株制作成懸混液，每個(gè)卵黃內(nèi)接種0.2mL，分別接種到4只1日齡的SFP雛雞體內(nèi)，雛雞死亡之后，迅速解剖，采集其十二指腸病變腸道組織，將其分解成1mm3的小塊，放置在2.5%的戊二醛中充分固定，然后再使用PH為7.4的PBS緩沖稀釋液充分沖洗，按照相應(yīng)的操作方法進(jìn)行脫水包埋切片處理，然后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，將處理好的切片放置在輻射電子顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)置4只接種滅菌生理鹽水的對(duì)照雞，每只雞卵黃內(nèi)接種滅菌生理鹽水0.2mL，單獨(dú)隔離養(yǎng)殖，三天之后處死解剖，選擇十二指腸組織，按照上述方法進(jìn)行制片觀察;其次，通過(guò)掃描電鏡觀察雛雞腸黏膜。將分離得到的菌株制作成懸混液，并接種到雛雞的口腔上皮細(xì)胞當(dāng)中，雛雞死亡之后取十二指腸組織，將其切割成1mm3的小塊，放置在2.5%的戊二醛中充分固定，然后再使用PH為7.4的PBS緩沖稀釋液充分沖洗，然后依次通過(guò)30%、50%、70%、80%，85%、90%、95%、100%的丙酮系列脫水，各處理10分鐘之后，然后再使用乙酸乙酯脫水，15分鐘裝入到樣品框當(dāng)中，放置在臨界點(diǎn)干燥儀器當(dāng)中充分干燥，取出之后粘著在樣品臺(tái)上，放置在制離子濺射儀內(nèi)進(jìn)行金噴度，作用三分鐘之后，放置在電鏡下進(jìn)行觀察。在采用上述手段進(jìn)行腸道組織檢查的同時(shí)，還應(yīng)該設(shè)置對(duì)照組。選擇同等數(shù)量的一日齡雛雞，經(jīng)口腔接種滅菌的生理鹽水，每只雞口腔接種0.2mL。隔離養(yǎng)殖三天之后處死，按照上述相同的實(shí)驗(yàn)室方法采集并料進(jìn)行常規(guī)染色，放置在電子顯微鏡下觀察。

2、結(jié)果與分析

經(jīng)卵黃的接種致病性沙門氏菌之后，與口腔接種的病死雛雞一樣，沙門氏菌均可以引起雛雞腸黏膜的微絨毛顯著萎縮減少脫落，并在前腸黏膜表面出現(xiàn)不平整的病理學(xué)變化。對(duì)照組的雛雞腸粘膜微絨毛整齊均勻，分布一致，生長(zhǎng)正常，沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的損傷現(xiàn)象。經(jīng)口腔和雞胚接種沙門氏菌的雛雞可以看到，細(xì)菌吸附在腸黏膜的微絨毛上或嵌入到微絨毛當(dāng)中，細(xì)菌感染附近的微絨毛長(zhǎng)短不一，形態(tài)不一致。而對(duì)照組雛雞的腸黏膜微絨毛正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)均勻，不存在任何細(xì)菌附著現(xiàn)象。由此可以看出致病性沙門氏菌群有十分廣泛的侵染途徑，并且不同情感途徑都會(huì)造成雞的腸道黏膜損傷，引發(fā)一系列的臨床癥狀。感染沙門氏菌雞腸粘膜電鏡觀察如圖1所示。

3、討論

目前沙門氏菌仍然是制約家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要傳染性疾病，該種致病菌不僅能夠?qū)崿F(xiàn)水平傳播，更重要的能夠通過(guò)寄生在雞蛋的表面實(shí)現(xiàn)垂直傳播，導(dǎo)致培育出來(lái)的雛雞天然攜帶有沙門氏菌，一旦飼養(yǎng)管理不當(dāng)，就會(huì)引發(fā)一系列的傳染性疾病。雞群感染沙門氏菌之后所表現(xiàn)出來(lái)的臨床癥狀為腹瀉，采食量下降，出現(xiàn)嚴(yán)重的消化不良等癥狀。為了進(jìn)一步掌握水平傳播和垂直傳播感染對(duì)沙門氏菌消化道產(chǎn)生的影響，本次實(shí)驗(yàn)主要設(shè)置了口腔接種和卵黃接種兩種感染途徑，通過(guò)對(duì)兩種感染途徑進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不管是卵黃接種還是口腔接種，均可以引起消化道黏膜表面出現(xiàn)相同的病理學(xué)變化。由此可以看出，不管是消化道感染還是卵蛋垂直感染，沙門氏菌通過(guò)各種途徑侵入機(jī)體之后都會(huì)在消化道內(nèi)從區(qū)域繁殖并產(chǎn)生大量的致病毒素，引發(fā)相應(yīng)的病理過(guò)程。當(dāng)雛雞的腸道黏膜微絨毛存在損傷，或存在明顯的缺損現(xiàn)象之后，機(jī)體對(duì)各種飼料的消化吸收率顯著下降，出現(xiàn)消化系統(tǒng)的病理學(xué)狀態(tài)，會(huì)嚴(yán)重影響到雛雞的正常生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致身體抵抗能力下降。另外由于沙門氏菌具有十分廣泛的寄生途徑和傳播途徑，患病雞排出的糞便當(dāng)中攜帶有大量致病源，污染飼料，飲用水飼養(yǎng)用具和周圍環(huán)境之后，很容易通過(guò)消化道反復(fù)侵染健康雞群，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)反復(fù)發(fā)病，反復(fù)感染，造成的危害十分嚴(yán)重。因此在今后雞養(yǎng)殖過(guò)程中，為了防范沙門氏菌病的進(jìn)一步傳播蔓延，應(yīng)該充分了解沙門氏菌的侵染途徑和侵染造成的危害，然后為養(yǎng)殖戶制定針對(duì)性的防控措施。在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該重點(diǎn)做好養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生消毒工作，控制合理的養(yǎng)殖密度，及時(shí)清理養(yǎng)殖場(chǎng)的各種糞便污染物，避免沙門氏菌病的寄生傳播。在分離養(yǎng)殖場(chǎng)的致病菌的同時(shí)，還應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)格的流行病學(xué)調(diào)查和藥品實(shí)驗(yàn)，在該種疾病流行高發(fā)期，可以在飼料或飲用水中添加相應(yīng)的高敏抗生素進(jìn)行預(yù)防，提高雞群對(duì)該種疾病的抵抗能力降低發(fā)病率。

（作者單位：130062吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）