miR-146a對甲狀腺相關眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8 的調節作用

李凱軍 陳俊

摘要：目的：探討miR-146a對甲狀腺相關眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8的調節作用。方法：本研究設實驗組和對照組兩組，通過原代細胞培養技術獲得體外培養眼眶成纖維細胞，再利用攜帶目的基因的慢病毒轉染眼眶成纖維細胞，過表達或抑制眼眶成纖維細胞miR-146a的表達水平，進而通過ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達水平。結果：TAO患者眼眶成纖維細胞48h上清液中IL-6和IL-8水平明顯升高，結果與正常組有統計學差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細胞中，上調miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時，下調miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。結論：過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達。

關鍵詞：甲狀腺相關性眼病，眼眶成纖維細胞，miR-146a，IL-6，IL-8

【中圖分類號】R581.3??? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2019）03-022-02

引言

甲狀腺相關性眼病（Thyroid-associated ophthalmopathy， TAO），是一種器官特異性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纖維細胞是甲狀腺相關眼病的自身免疫靶點和效應細胞[2]。IL-6是主要的促炎細胞因子[3]。成纖維細胞中IL-8的產生參與甲狀腺相關眼病炎癥進展[4]。

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調節，細胞增殖，分化，凋亡，細胞外基質代謝和其他生命過程[5]。楊文娟等[6]發現，甲狀腺相關眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個核細胞的miRNA-146a相對表達量較正常人明顯下降。然而，miR-146a對眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的影響仍不清楚。本研究旨在通過原代細胞培養技術獲取純化的眼眶成纖維細胞，利用攜帶目的基因的慢病毒轉染眼眶成纖維細胞，過表達或抑制miR-146a的表達水平，進而利用ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達水平，探討miR-146a對甲狀腺相關眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8的調節作用。

方法

1.實驗材料

實驗組：因暴露性角膜炎、壓迫性視神經病變或限制性眼外肌病變行眼眶減壓術或斜視矯正術的甲狀腺相關眼病患者6例，術中取眼眶球后結締組織。

對照組：因眼外傷等原因引起眼球萎縮行眼球摘除術及義眼座植入術以及二期義眼座植入術6例，術中取眼眶球后結締組織。

1.慢病毒的構建及慢病毒轉染眼眶成纖維細胞的條件

本實驗需要的含目的基因的重組慢病毒載體由上海基凱基因公司協助構建完成，根據上海基凱基因公司所提供的慢病毒感染實驗手冊指導實驗。

2.轉染后ELISA檢測眼眶成纖維細胞Il-6和IL-8的表達水平

取生長良好的眼眶成纖維細胞，調整細胞密度，各組眼眶成纖維細胞按4x104/ml接種6孔板，培養箱中培養48h后，收集各組上清液，參照ELISA試劑盒使用說明，檢測細胞上清液中Il-6和IL-8的表達水平。

3.統計學分析

實驗結果采用SPSS 20.0對數據進行統計學分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

結果轉染后ELISA檢測眼眶成纖維細胞Il-6和IL-8的表達水平

TAO患者眼眶成纖維細胞較正常眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8水平明顯升高，結果與正常組有統計學差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細胞中，上調miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時，下調miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。在正常人眼眶成纖維細胞，上調miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;下調miR-146a表達水平，IL-8水平升高（P<0.05）。

討論

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調節，細胞增殖，分化，凋亡，細胞外基質代謝和其他生命過程[7]。Sun等[8]通過qPCR比較甲狀腺相關眼病和非甲狀腺相關眼病患者眼眶脂肪組織中miR-146a的表達水平，結果發現眼眶成纖維細胞中的炎性應激能使miR-146a上調。楊文娟等[6]發現，甲狀腺相關眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個核細胞的miRNA-146a相對表達量較正常人明顯下降。然而，本實驗研究TAO患者眼眶成纖維細胞較正常眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8水平明顯升高。由此可見，在自身免疫性疾病中，miR-146a的表達可能有不同的復雜機制。

IL-6在甲狀腺相關眼病中也有重要的作用。已有研究表明，眼眶容量與IL-6mRNA的表達呈正相關，與IL-4mRNA、IL-10mRNA呈負相關[9]。相較于非活動性甲狀腺相關眼病患者，活動性甲狀腺相關眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受體濃度明顯升高[3]。Ning等[10]發現與對照組相比，甲狀腺相關眼病患者外周血的miR-146a的相對表達顯著增加，而Notch2的相對表達明顯降低，且 Notch2可以被miRNA-146a直接作為靶向目標。外源性miRNA-146a模擬物可下調Notch2的表達和上調IL-6。抑制miRNA-146可以導致Notch2的表達升高和IL-6的表達降低。這些結果說明miR-146a可通過直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，從而促進甲狀腺相關眼病的發展。在我們的研究中，過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6的表達。

IL-8是促炎趨化因子，具有誘導中性粒細胞沿著血管壁的聚集的作用[11]。在甲狀腺相關眼病中，各種類型的成纖維細胞以及這些細胞中IL-8的大量產生參與疾病炎癥進展[12]。在眼眶炎癥中，眼眶成纖維細胞在一些細胞因子的刺激下，如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ，產生劑量依賴的IL-8和MCP-1[13]。在我們的研究中，過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-8的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-8的表達。

過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達，抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達。提示miR-146a可能與甲狀腺相關眼病疾病的發生發展有關。

參考文獻

[1]Maheshwari R， Weis E. Thyroid associated orbitopathy. Indian journal of ophthalmology 2012;60：87-93.

[2]van Steensel L， Dik WA. The orbital fibroblast： a key player and target for therapy in graves' ophthalmopathy. Orbit 2010;29：202-6.

[3]Salvi M， Girasole G， Pedrazzoni M， et al. Increased serum concentrations of interleukin-6 （IL-6） and soluble IL-6 receptor in patients with Graves' disease. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996;81：2976-9.

[4]Du L， Yang J， Huang J， et al. The associations between the polymorphisms in the CTLA-4 gene and the risk of Graves' disease in the Chinese population. BMC medical genetics 2013;14：46.

[5]Yang L， Boldin MP， Yu Y， et al. miR-146a controls the resolution of T cell responses in mice. The Journal of experimental medicine 2012;209：1655-70.

[6]楊文娟， 班勝剛， 何劍峰. 甲狀腺相關眼病患者外周血單個核細胞中微小RNA-146a的異常表達及意義. 眼科新進展 2012：414-7.

[7]Contreras J， Rao DS. MicroRNAs in inflammation and immune responses. Leukemia 2012;26：404-13.

[8]Jang SY， Chae MK， Lee JH， et al. Role of miR-146a in the Regulation of Inflammation in an In Vitro Model of Graves' Orbitopathy. Investigative ophthalmology & visual science 2016;57：4027-34.

[9]Hiromatsu Y， Yang D， Bednarczuk T， et al. Cytokine profiles in eye muscle tissue and orbital fat tissue from patients with thyroid-associated ophthalmopathy. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2000;85：1194-9.

[10]Wang N， Chen FE， Long ZW. Mechanism of MicroRNA-146a/Notch2 Signaling Regulating IL-6 in Graves Ophthalmopathy. Cell Physiol Biochem 2017;41：1285-97.

[11]Ghasemi H， Ghazanfari T， Yaraee R， et al. Roles of IL-8 in ocular inflammations： a review. Ocular immunology and inflammation 2011;19：401-12.

[12]Koumas L， Smith TJ， Phipps RP. Fibroblast subsets in the human orbit： Thy-1+ and Thy-1- subpopulations exhibit distinct phenotypes. European journal of immunology 2002;32：477-85.

[13]Elner VM， Burnstine MA， Kunkel SL， et al. Interleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 gene expression and protein production by human orbital fibroblasts. Ophthalmic plastic and reconstructive surgery 1998;14：119-25.