一種傷口修復密封膠的研制及性能評價

【摘要】：生物粘合劑具有良好的粘性與生物相容性，對于傳統機械傷口的修復是一種很好的選擇，目前在生物醫學領域受到廣泛的關注。傳統的水凝膠力學性能差，缺乏細胞親和性和組織粘附性，不能滿足修復傷口的需求【1】。以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和巰基化的膠原（COL-SH）為原料，制備水凝膠【2】。該快速交聯生物可降解水凝膠以其優異的凝膠降解和生物活性等可為生物組織工程提供理想的三維活性多孔支架。

【關鍵詞】： 生物粘合劑 聚乙二醇二丙烯酸酯 膠原

1、傷口修復水凝膠的優越性

為促進開放性傷口的愈合，臨床上傳統采用針線縫合、密封劑密封、或者重新連接破裂組織的方式，保護和修復創面，達到傷口愈合的目的。但是這些方法存在一定的缺陷，如對傷口造成二次機械損傷，細胞排斥免疫，粘附性低以及在生物環境中性能不良等問題【3】。近年來，國內外學者致力于研究具有粘性、彈性、生物相容性、無毒等優良性狀的傷口密封水凝膠。水凝膠具有原位型促進傷口愈合的優點，因而關于該領域的研究在國內外掀起了熱潮。例如，以硼酸為交聯劑制備Cur（姜黃素）/PVA（聚乙烯醇）水凝膠，能夠大規模合成，不受尺寸限制，并且能有效殺死細菌，加速大鼠皮膚創傷愈合【4】；肽修飾殼聚糖水凝膠促進成纖維細胞增殖，遷移和分泌以及促進生長因子的生長進.促進皮膚愈合【5】；由重組蛋白或白蛋白形成的用于外科手術粘合的生物粘合劑；由藻酸鹽多糖制備的傷口敷料；利用可見光固化的肝素水凝膠，不僅可以引入生長因子，而且能夠減少凝膠形成時間【6】；通過光交聯重組人蛋白質原彈性蛋白，形成具有可調粘附性能的生物相容性和高彈性水凝膠密封劑【7】。水凝膠具有三維高度水合的聚合物網絡，當放在溶液中時，與干重相比，可以容納多達二十至四十倍的水。由于其獨特的物理性質，這些網絡可以成型或鑄造成各種大小和形狀。膠原作為天然的高親水性的多肽類高分子，是生物體內的一種纖維蛋白，在人體中總蛋白含量中占25%-33%，大量存在于骨，軟骨和皮膚中。采用膠原作為材料具有低免疫原性，膠原雖然是大分子物質 ，但結構重復性大，與其他具有免疫性的蛋白質相比，膠原的免疫原性非常低；膠原材料另一優勢在于它與宿主細胞及組織之間良好的相互作用即生物相容性，其可與周圍細胞表現出很好的相互作用，并成細胞的一部分，還可促進細胞的生長；膠原發達的四級結構使其具有一定的凝血作用，可促進血小板凝集和血漿結塊；另外膠原還具備能被蛋白酶降解的特性 ，即可生物降解性【8】。聚乙二醇（PEG）具有水溶性，并可溶于絕大多數的有機溶劑，且具有生物相容性好、無毒、免疫原性低等特點，并且在生物體內可被較快代謝，通過腎排出體外，在體內不會有積累。PEG可將其許多優異性能賦予被修飾的物質，作為表面修飾材料，PEG還可有效延長水凝膠在體內的半衰期【9】。在本實驗中，采用PEGDA（聚乙二醇二丙烯酸酯）與巰基化膠原為基本材料，進行自發交聯，形成具有一定生物粘性的水凝膠。對PEG兩端羥基進行雙鍵修飾，得到PEGDA，其雙鍵可與巰基化膠原的巰基發生鍵合，從而發生交聯，得到具有一定粘附性和一定機械強度的水凝膠。采用該方法所制備的水凝膠具有良好的生物相容性，無毒，并且無需引發劑可自發交聯等顯著優點。

2、實驗方法

2.1 COL-SH的制備【10】

將膠原（1g，0.0125mmol）溶于去離子水（150ml）中，然后用NaOH調節溶液PH=10。在4℃的條件下將琥珀酸酐（15g，0.15mol）溶于丙酮中，然后將該混合溶液滴加到膠原溶液之中。將反應混合物的pH保持在pH9.0，并在4℃下攪拌混合物4小時。然后將該反應溶液在去離子水中透析（MWCO=14000KDa）24h，并通過冷凍干燥收集Col-COOH產物.通過TNBSA測定測定的COL-COOH中剩余胺基的量為零，表明COL-COOH中羧基的DS（取代度）接近100%。將EDC（0.5g，2.6mmol）、NHS（0.3g，2.6mmol）和MEA（0.2g，1.76mmol）的水溶液依次加入到溶在去離子水（50ml）中的Col-COOH（0.5 g， 0.00625 mmol），將反應混合物的PH用HCL（1.0M）調節至5.5，并在室溫下攪拌混合物24h，然后用NaOH（4.0M）將溶液PH調節至8.5并用DTT（二硫蘇糖醇）（1.5g，9.7mmol）處理24h。將反應混合物用鹽水透析24h，去離子水透析5h。凍干后，得到白色固體Col-SH。

2.2 COL-SH與PEGDA交聯成凝膠

按COL-SH：PEGDA質量比分別為1：50、1：100、1：200進行混合，發生自身交聯，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.3 COL-SH與PEGDA交聯成凝膠

按COL-SH：PEGDA質量比分別為1：50、1：100、1：200進行混合，發生自身交聯，得到半透明凝膠，將凝膠凍干后備用。

2.4溶脹實驗（質量分析法）【11】

將干凝膠W0浸泡于20mL PBS中（PH7.4，25℃），分別在1min、3min、5min、10min、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h稱量凝膠的質量Wt，多余的水分用濾紙吸去，計算吸水率。

2.5.降解實驗【11】

將100mg的干凝膠浸泡于含膠原蛋白酶（5U/ml）的PBS溶液中，在37℃、100rmp/min下震蕩， 4h，8h，24h在各時間點離心除去含有膠原蛋白酶的溶液，用PBS溶液洗滌兩次，再離心，隨后冷凍干燥。降解率根據以下公式結算計算：W0為初始干重，W1為酶解后干重。

2.6水凝膠的微觀形態分析

使用掃描電子顯微鏡（日本日立公司 SU1510）觀察水凝膠（COL-SH：PEGDA=1：100）的的內部結構。先將水凝膠樣品冷凍干燥。然后將其切開以觀察其內部結構。

3、實驗結論

實驗制備了COL（膠原）與PEGDA質量比為1：50、1：100、1：200的水凝膠，通過水凝膠形貌、溶脹性能、水溶解性能和酶溶解性能測試證實了COL與PEGDA質量比為1：200的水凝膠的性能整體較好。在SEM電鏡圖中，可明顯看出水凝膠具有不規則的較密的膜狀三維網絡結構，此結構不僅能夠提高水凝膠的力學強度，而且可以很好的解釋水凝膠能夠溶脹拉伸等行為的現象。在溶脹實驗中，1：200水凝膠的溶脹比較小且變化平穩，其交聯程度最好。因為水凝膠的形成是由于PEGDA之間形成了凝聚纏結結構，該纏結結構是由PEGDA鏈間羥側基間形成的氫鍵締合結構而引起的，其作用類似于交聯網絡結構中的交聯點。當PEGDA濃度增加時，單位體積內PEGDA分子數增加，形成鏈間氫鍵凝聚纏結點數目增加，亦即交聯度增加，故溶脹比減小。通過水溶解實驗，發現COL與PEGDA的質量比對水凝膠的水溶解性有顯著影響，隨著PEGDA的增加可以促使水凝膠的溶解。PEGDA比例較大的水凝膠更易于與傷口融合，能更好的在體內降解，促進傷口的愈合。在水凝膠的酶降解曲線中，1：200水凝膠的酶降解速率最快，可見此比例的水凝膠在生物體內能夠更好的降解，更有利于傷口的愈合與生長。通過上述系列實驗，可以認為COL與PEGDA質量比為1：200的水凝膠更利于促進傷口的愈合與生長，縮短傷口愈合的時間，更適合作為傷口敷料。

【參考文獻】：

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【11】陳會男. 抗菌醫用水凝膠敷料的制備及性能研究[D]. 南京理工大學， 2017.

作者簡介：姓名：于慧光（1997-） 性別：男 民族：漢 籍貫：河南省信陽市 學歷：本科 研究方向：藥劑學 單位：江南大學