天麻丸新版藥典微生物檢驗方法探究

趙業輝 丁小玲

摘 ?要：目的主要是在結合實際的基礎上促使天麻丸的微生物限度檢查方法得以順利建立。方法將中國藥典2015年版四部非無菌產品微生物限度檢查方法作為主要依據，促使方法適用性試驗得以順利開展。結果其中兩個企業在實際檢查過程中使用的方法為常規檢查，其余兩個企業主要是借助稀釋法進行檢查工作。結論在消除產品抑菌成分對微生物檢驗的影響方面稀釋法起著不可替代的重要作用。

關鍵詞：微生物限度檢查;天麻丸;中國藥典

天麻丸在中成藥品種涵蓋范圍之內，其中包含10味中藥材，主要涉及到天麻、羌活、獨活、地黃等，在此基礎上進行加工可實現對成水蜜丸，小蜜丸和大蜜丸的有效煉制，現階段市場內一般銷售的品種為水蜜丸以及大蜜丸。加入適當的生藥原粉是中成藥丸劑的主要生產工藝，這也是藥品安全高度重視，微生物的負載和污染菌的狀況的主要原因。最新版中國藥典與傳統藥典相比有相當大的變化，在實際試驗過程注意對其進行科學借鑒。

一、儀器、材料與樣品

1.儀器

Thermo1378生物安全柜;InterScienceS500自動菌落計數器;ThermoIGS180培養箱;SanyoMIR254生化培養箱;TomySX-700高壓滅菌器。

2.培養基

大豆酪蛋白胨瓊脂培養基，大豆酪蛋白胨液體培養基，沙氏葡萄糖瓊脂培養基，腸道菌增菌液體培養基，麥康凱肉湯培養基等都可在這一試驗中進行使用，注意結合實際與試驗要求也可科學選擇，麥康凱瓊脂培養基，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂，RV沙門菌增菌肉湯培養基，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂，三糖鐵瓊脂等培養基。

需要注意的是上述培養基的提供單位都為廣東環凱微生物科技有限公司生產。北京三藥科技開發公司所提供的培養基為沙氏葡萄糖液體培養基，4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基。在實際使用之前我們必須針對培養基進行嚴格的適用性檢查，檢查結果符合相關標準與要求的才可以真正投入使用。

3.菌種

金黃色葡萄球菌（S.aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[CMCC（B）63501]大腸埃希菌（E.coli）[CMCC（B）44102]白色念珠菌（C.albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（A.niger）[CMCC（F）98003]、乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphiB）[CMCC（B）50094]均來自中國食品藥品檢定研究院醫學菌種保藏中心，試驗菌為第3代菌株。

二、方法與結果

1.菌液制備

大豆酪蛋白胨液體培養基主要接種對象為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌，注意將溫度控制在30-35℃范圍之間，培養時間為18-24h。沙氏葡萄糖液體培養基接種對象為白色念珠菌接種，需要在20-25℃的范圍之內培養2-3d。

黑曲霉主要是在沙氏葡萄糖瓊脂培養基中進行接種，其溫度也需要控制在20-25℃之間，但其培養時間較長，需要5-7d。在實際針對孢子進行洗脫工作的過程當中我們需要借助0.05%的聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液。最后將上述菌株制成菌液備用，注意起級別為稀釋級，這一過程中所使用的溶液為0.9%無菌氯化鈉溶液。

2.實驗方法

（1）微生物計數方法適用性試驗-平皿法

取供試品10g，加大豆酪蛋白胨液體培養基至100mL，勻漿，靜置約5min，取上層液體即為1∶10供試液，取1mL注皿，分別傾注大豆酪蛋白胨瓊脂培養基及沙氏葡萄糖瓊脂培養基，作為供試品對照組。

另取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供試液，混勻，使每毫升混合液含菌量不大于100cfu，取上述混合液1mL注入平皿，傾注大豆酪蛋白胨瓊脂培養基，每個菌株分別制備2個平板，取白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1mL加至9.9mL上述供試液，混勻，使每毫升混合液含菌量不大于100。

（2）微生物計數方法適用性試驗———稀釋法

制作供試品對照組及菌液組，培養，計數，計算回收比值。2.2.3控制菌檢查方法適用性試驗耐膽鹽革蘭陰性菌檢查：按照“2.2.1”方法制備1∶10供試液，置20～25℃培養約2h，取相當于供試品0.1、0.01、0.001g的預培養物分別加至10mL的腸道菌增菌液體培養基中，一式2份，其中1份3管每管中加入不大于100cfu的大腸埃希菌，另1份3管每管中加入不大于100cfu的銅綠假單胞菌，按照藥典規定方法培養后，每管分別劃線接種到紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，培養后觀察結果。

三、討論

考察了4個廠家5個品種的天麻丸的微生物限度檢查方法，雖然都是按照中國藥典2015年版的處方進行生產，但其產品對微生物的檢出有不同程度的干擾現象，部分產品應采用稀釋法進行檢查，才能順利檢出樣品中可能污染的微生物，究其原因，可能與原藥材產地、炮制方法、不同輔料對微生物生長環境的影響、還有生產工藝有一定的關系。

說明同一品種不同企業生產的產品不能死搬硬套同一種微生物限度檢查法，而應該經過方法適用性確定其可行性;企業生產的同一個品種，在原藥材產地、批次、炮制方法以及生產工藝發生改變的時候，也應該進行方法確認其檢查方法的可行性;藥檢所對抽驗藥品進行檢驗時，遇到不同企業的產品，在條件許可的情況下，也應盡可能獲取相應的檢驗方法資料。

關于稀釋法的操作，本試驗中菌落計數方法采用了取1∶50供試液1mL注皿的稀釋法（最后5皿合并計數），與采用中國藥典2010年版收載的培養基稀釋法（取1∶10供試液1mL分注5皿，每皿0.2mL），在每皿中的供試液濃度是一樣的，但在方法適用性試驗加菌的操作中，提前加到稀釋液中，制成的最終濃度供試液就和菌液混合，更實際模擬檢驗過程中微生物的生長環境特性，而后者是在傾注培養基的時候供試液才與菌液混合，使抑菌成分對微生物的作用可能被培養基部分稀釋掩蓋了，過程試驗對抑菌成分的模擬效果有一定的試驗偏差。

結語

新版藥典與以往版本的藥典相比，計數方法限度采用了指數方式來表示，引入了可接受的最大菌數的概念，針對微生物試驗的特性，用數理統計的方法，從給藥途徑、藥品特性、使用方法方面對藥品進行風險評估，提高用藥的安全性保障。

參考文獻

[1]管中玉，趙吉平，馬則秀.HPLC法測定天麻丸中天麻素的含量[J].湖南中醫雜志，2010，26（4）：121-122.

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