玉米ZmLBD7基因的序列變異分析

滕青 尹雙義

摘 要：LBD基因編碼植物一類特有的轉錄因子，在植物生長發育中具有至關重要的作用。為分析特異在玉米穗部表達的ZmLBD7基因的核苷酸多樣性，基于目標序列定點捕獲對280個玉米自交系中的ZmLBD7位點進行了重測序。結果發現該基因在供試群體中有52個變異位點，其中32個為SNP，20個屬于indel變異。由于該基因在演化過程中缺少遺傳重組，該基因表現出偏離中性進化的特征，并且其編碼區的5個變異僅等導致2種單倍型，編碼2種蛋白質。

關鍵詞：玉米;ZmLBD7基因;序列變異;遺傳重組

LBD基因家族編碼植物特有的一類轉錄因子，其蛋白序列中包含保守LOB結構域（Lateral organ boundaries domain）。[1]該基因家族成員最初是通過增強子陷阱的方法，在擬南芥中鑒別出一個在側生器官基部特異表達的基因，并將其命名為LOB基因。[2]根據編碼蛋白質序列的氨基酸組成特征，擬南芥中的LBD基因可以分為兩種類型，其中I類LBD基因編碼蛋白質序列中的典型特征是具有一個非常保守的CX2CX6CX3C鋅指類結構域和一個LX6LX3LX6L結構域，而II類LBD基因編碼的蛋白質序列中只具有保守的鋅指類結構域。[3]基于對擬南芥、水稻、毛果楊、番茄和紫花苜蓿等模式植物基因組的分析，發現LBD基因屬于多基因家族，在多數植物基因組中通常含有20-60個左右的LBD基因[1，4]。在多個植物物種中對LBD基因的功能進行了闡釋，發現該基因家族主要參與高等植物側生器官的形態建成，特別是在側生器官與頂端分生組織之間邊界的形態建成起到關鍵作用[5];除此之外，一些LBD基因還參與氮素的吸收同化等植物的次級代謝。[6]

玉米（Zea mays L.）是我國第一大糧食作物，也是全世界重要的糧食作物之一。已有研究表明，玉米的LBD基因在其生長發育中具有重要的作用。玉米的RTCS基因屬于LBD基因家族，其具有典型的轉錄因子特征，其突變體rtcs植株僅有一條初生根，缺失種子根和節根。[7]玉米的IG1基因也屬于LBD基因家族，通過突變體分析發現該基因能夠調控玉米葉片形態和胚囊發育。[8]全基因組分析發現玉米基因組中至少具有44個LBD基因，[9]其中基于玉米的轉錄組分析發現ZmLBD7基因（GRMZM2G076327）特異的在穗部表達，[10]表明其可能與穗部性狀發育有關。該基因位于玉米的1號染色體，編碼的蛋白質序列中具有LOB結構域。因而，在自然群體中分析ZmLBD7基因的序列變異，并闡明其與穗部性狀的關聯，將為玉米穗部性狀的遺傳改良提供重要的借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為來自于我國玉米常用自交系和來自于國外的核心玉米種質，共計280份玉米自交系。

1.2 DNA提取和ZmLBD7基因測序

供試玉米種質在實驗室中采用水培方式種質，在出苗15d后剪取頂端嫩葉，并采用改良的CTAB法提取基因組DNA。DNA濃度利用分光光度計檢測，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測提取的DNA質量。以玉米自交系B73的ZmLBD7基因序列為捕獲模板，采用NimbleGen平臺在供試玉米材料中對為該基因位點進行目標序列定點捕獲，并進行目標片段重測序。基因組序列的目標序列定點捕獲和重測序均由華大公司完成。

1.3 數據分析

通過Clustal X軟件[11]對玉米ZmLBD7基因的全長序列進行比對，比對后的結果用于進行序列分析。采用DNAsp軟件[12]進行序列變異參數的計算：包括核苷酸多樣性參數π和θ，中性進化參數Tajima's D[13]、Fu與Li的D*和F*[14]，和連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）特征值r2。LD隨距離的衰減曲線參照Remington等[15]定義的非線性回歸方程。

2 結果與分析

2.1 玉米ZmLBD7基因的序列變異

以玉米自交系B73的ZmLBD7基因（GRMZM2G076327）的全長序列作為模板，在280個自交系種質中定點捕獲了該位點的序列。經多序列比對，共得到2458bp的ZmLBD7基因全長序列，其中啟動子區段1158bp，第一外顯子區段366bp，內含子區段89bp，第二外顯子區段378bp，3端序列438bp。進一步分析發現，該基因位點中共包含52個變異，涵蓋115個核苷酸位點（表1）。其中31個屬于SNP變異位點，平均每79.3bp有1個SNP;共有21個indel變異，平均每117.0bp有1個indel。根據該基因的注釋信息，其包含2個外顯子區段和1個內含子區段。內含子區具有較高的變異頻率，平均每17.8bp便有1個變異（包括SNP和indel）。在第一個外顯子區域發現了2個SNP和1個indel，而在第二個外顯子區域僅發現了2個SNP，未發現indel。

核苷酸多態性通常用參數π和θ作為衡量的指標，其中π是衡量同一位點不同序列兩兩之間差異的參數;而θ則是衡量群體突變率的參數指標，與核苷酸變異占序列位點數的比率有關。ZmLBD7基因全長序列（含啟動子區）的π值為0.0051，θ值為0.0021（表2）。在中性進化的條件下，核苷酸多樣性的兩個參數π和θ的值應該近似相等。而Tajima's D測驗可以通過比較群體突變率的2個估計值π和θ的差異來檢驗選擇效應。利用玉米ZmLBD7基因序列中的多態性位點進行了中性進化檢測，結果發現ZmLBD7位點的Tajima's D值均為正值，且均達到了顯著水平。此外，全長序列的Fu與Li的D*和F*的測驗值分別為2.0405和3.4103，均達到了顯著水平。這些結果表明該基因位點存在大量的中等頻率的等位變異，可能是由于群體瓶頸效應或對該基因位點平衡選擇的結果。

2.2 ZmLBD7基因的單倍型分析

根據所測玉米ZmLBD7基因的核苷酸變異信息，可以將280份玉米自交系劃分成7個單倍型，分別命名為H01-H07（表2）。單倍型H01所包含的自交系數目最多，為96個，占供試材料的34.29%。除H06之外，其余的單倍型均包含2個及以上的自交系。ZmLBD7基因的編碼區具有4個SNP變異位點和1個indel變異位點，這些核苷酸位點的多態性可以將供試材料劃分成2種單倍型，分別命名為HC01和HC02。其中181個自交系屬于HC02，占所有供試材料的64.6%。

2.3 ZmLBD7基因的連鎖不平衡和遺傳重組

對最低等位基因頻率在0.05以上的變異位點進行了連鎖不平衡分析，并以位點距離和連鎖不平衡參數r2構建了散點圖，結果發現在ZmLBD7位點連鎖不平衡衰退非常慢，在該基因區段沒有衰減至0.1以下（圖2）。進一步對玉米ZmLBD7基因位點的所有多態性位點估算了最小遺傳重組數，但并未檢測到明顯的遺傳重組，這可能是導致連鎖不平衡衰減緩慢的主要原因。

3 小結與討論

自然群體中豐富的核苷酸變異是作物遺傳改良的基礎，因而分析功能基因的遺傳變異不僅能揭示目的基因的遺傳演化規律，還將為基因的功能鑒定提供重要的借鑒。核苷酸變異包括SNP和indel兩種形式，其中SNP是在基因組中發生頻率高、數量多、密度大。[16，17]本研究中發現ZmLBD7位點也具有豐富的變異，在280個玉米自交系中共發現了52個變異，但是大部分變異分布在上游的啟動子區域。此外，內含子區域具有較多的變異，平均每17.8個堿基存在一個變異。通常情況下，由于外顯子區段受到較多的選擇壓力，往往會導致較少遺傳變異的產生。本研究中也發現玉米ZmLBD7基因在外顯子區段的變異要遠低于啟動子區段和內含子區段，僅僅有5個變異。

本研究還發現玉米ZmLBD7基因不僅連鎖不平衡衰退的較慢，還偏離了中性進化。其中性進化參數Tajimas D、Fu and Li's D*和F*均為正值，表明在該基因位點上存在大量的中等頻率的突變，根據中性進化學說可能是由于群體瓶頸效應，群體結構，或者平衡選擇引起的。因本自然群體來源較為豐富，而且也具有豐富的變異，因而可能是由于對該基因的平衡選擇導致了其偏離中性進化。進一步分析發現該基因盡管存在了一些變異，但是沒有檢測到遺傳重組，說明對該基因的平衡選擇導致了其連鎖不平衡衰退的較慢，進而導致了其偏離了中性進化。

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