抵抗素通過TLR4/MyD88依賴途徑促進牛肺泡巨噬細胞炎癥因子產生①

岳夢佳 左之才 陽明賢 李 碧 岑 垚 姚彩霞

(四川農業大學動物醫學院，環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，溫江 611130)

抵抗素(Resistin,RETN)，是一種胰島素的負調節物，通過拮抗肝臟、骨骼肌和脂肪等組織中的胰島素減少機體對葡萄糖的吸收，在調節能量平衡和代謝中具有重要作用[1,2]。但近年來，大量研究發現抵抗素還具有強烈促炎作用，更被認為是一種促炎細胞因子[3]。研究表明，抵抗素可由中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞大量分泌表達[4,5]，另外，抵抗素也可誘導IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子釋放，促使巨噬細胞由抗炎的M2型向促炎的M1型表達調控炎癥過程[6,7]。抵抗素的強烈促炎作用已被廣泛認可，且越來越多研究顯示炎癥是一種高水平的抵抗素狀態[8]，但其潛在的分子機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

Toll樣受體 (Toll like receptor,TLR) 作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[9,10]，其介導的信號轉導通路及其作用一直是科研人員研究的焦點。由髓樣分化因子88 (Myeloid differentiation primary respo-nse protein 88,MyD88) 承接的轉導途徑稱為MyD88依賴途徑，其他稱為MyD88非依賴途徑[11]。當MyD88分子被激活后，募集下游IL-1受體相關激酶 (Interleukin-1 receptor associated kinas,IRAK)，經過一系列信號傳導，最后活化核轉錄因子(Nuclearfactor kappa,NF-κB)[12,13]，導致促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等釋放增加，放大炎癥信號，誘發炎癥反應。

抵抗素能與TLR4發生直接相互作用，與TLR4-MD2復合物結合，誘發機體炎癥反應，在人單核白血病細胞(THP-1)上已得到證實[14]。然而，抵抗素的促炎作用及其細胞內的信號傳導機制尚未完全闡明，且缺少牛肺泡巨噬細胞的相關研究。本試驗基于抵抗素和TLR4信號通路在炎癥和生理方面的重要作用，利用牛抵抗素處理牛肺泡巨噬細胞，檢測TLR4/MyD88依賴途徑信號通路相關基因(TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB)mRNA和蛋白表達量以及下游促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平，初步探討抵抗素誘導條件下TLR4/MyD88依賴途徑信號通路相關基因的表達變化規律，以期為后續炎癥疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 高糖DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清購自生工生物有限公司；Premix Taq酶、反轉錄酶試劑盒購自TaKaRa公司；牛抵抗素(四川農業大學動物醫學院環境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室原核表達提取，且經內毒素去除試劑盒除去內毒素)；牛肺泡巨噬細胞采自健康牛新鮮肺部組織；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自南京建成試劑有限公司；單克隆抗體β-actin (4790；Cst)，TLR4(NBP2-24538SS；Novus)，MyD88(70R-50098；Fitzgerald)，IRAK4(AP23599PU-N；OriGene)，P65(NBP2-24541SS;Novus)；TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB、β-actin的檢測引物見表1，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1牛肺泡巨噬細胞的采集與分組 方法參照Xu等[15]實驗方法，肺泡巨噬細胞陽性分離率大于96%。無菌并含有200 U/ml青霉素、200 μg/ml鏈霉素的PBS，經4℃預冷處理，保存備用。采取眼觀無病變并保留10 cm以上氣管的完整水牛肺部，結扎氣管。PBS洗凈肺表面，將適量PBS經氣管灌入肺部，同時適當輕柔肺部，收集灌洗液，重復3次。灌洗液經200目紗布過濾，1 500 r/min離心10 min，收集細胞。PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心10 min。用含胎牛血清100 ml/L的細胞培養液(胎牛血清與DMEM 按1∶9體積混合)重懸細胞，細胞計數，置于37℃、5%CO2孵育箱內培養細胞6 h。PBS洗去未貼壁細胞，消化重懸細胞，調整細胞數為1×106個/ml，通過臺盼藍染色法計算細胞存活率， 分裝于6孔板中，置于細胞孵育箱內培養3 h。加終濃度為100 ng/ml 的抵抗素進行誘導，陰性對照添加等體積PBS，每組設置3個平行樣。分別離心收集誘導0、1.5、3、6、12、24 h后的上清液和下層細胞，上清液用于檢測IL-6、IL-1β和TNF-α 的含量，下層細胞用于檢測TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRNA水平以及蛋白表達。

表1 各基因熒光定量引物

Tab.1 Primer sequence of genes for Real-time PCR

GeneSequenceAccession No.TLR4F:CCTAGCAAGAGCAGAGAACCAGAAGNM-174198.6R:GTCACTGGTGGCTTCTTCTTCACAGMyD88F:AGAAGAGGTGCCGTCGGATGGXM-005222379.3R:TTGGTGTAGTCACAGACAGTGATGAAGIRAK4F:CTGTGGATGAACACCGTGAACCTCNM-001075998.1R:GACACTGACTGGCAACAGAGTACATAGNF-κBF:GAGATCATCGAGCAGCCCAAXM-002695167.5R:ATAGTGGGGTGGGTCTTGGTβ-actinF:GCCCATCTATGAGGGGTACGAF 191490.1R:TCACGGACGATTTCCGCT

1.2.2實時熒光定量 PCR檢測牛肺泡巨噬細胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB mRAN表達水平 采用Trizol法提取培養下層牛肺泡巨噬細胞總RNA，測定總RNA濃度及純度。參照試劑盒說明書進行反轉錄，cDNA保存于-20℃。以cDNA為模板，對TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB 的mRNA表達量進行檢測。cDNA進行10～105的10倍系列稀釋，制作標準曲線。實時定量PCR反應體系：上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Premix Taq 6.0 μl，模板 5.0 μl。反應條件95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，循環40次，每個循環后檢測熒光強度值。實時定量PCR的結果采用2-ΔΔCT法進行計算，用內參基因β-actin對各基因表達水平均一化，2-ΔΔCT法計算公式：ΔCT=CT目的基因-CT內參基因，ΔΔCt=ΔCT試驗組-ΔCT對照組。

1.2.3Western blot法檢測牛肺泡巨噬細胞中TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB等的蛋白水平 下層細胞加裂解液，煮沸5 min，14 000 r/min離心5 min；取離心后的樣本上樣(上樣量為20 μg總蛋白)；電泳程序(S1：90 V，15 min；S2：120 V，至結束)，蛋白樣品經電泳分離后，轉至硝酸纖維素膜上(100 V，90 min)；加50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h后，與 1∶1 000稀釋的兔抗TLR4 抗體、兔抗MyD88抗體、兔抗IRAK4抗體、兔抗NF-κB抗體、兔抗β-actin抗體，4℃孵育過夜；1×TBST洗膜5 min×3次后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG (1∶5 000)，室溫孵育1 h；1×TBST洗10 min×3次；增強化學發光法 (Enhanced chemiluminescent，ECL) 顯色，曝光。

1.2.4ELISA檢測牛肺泡巨噬細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α濃度 細胞上清離心，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β和TNF-α促炎細胞因子濃度。

2 結果

2.1抵抗素促進牛肺泡巨噬細胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的mRNA表達 將每個基因陰性對照的0 h的表達量設置為1，對TLR4/MyD88依賴途徑信號通路相關基因的Real-time PCR結果進行統計。結果發現，在100 ng/ml終濃度抵抗素誘導后，TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB mRNA表達量均明顯增加，如圖1。在抵抗素誘導后3 h，各基因變化均不顯著，當誘導6 h后，各基因表達量均極顯著升高(P< 0.01)，12 h 表達量最高。

圖1 實時定量PCR檢測牛肺泡巨噬細胞TLR4、MyD88、IRAK4 and NF-κB的mRNA表達水平Fig.1 Genes expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were tested by qRT-PCRNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

圖2 Western blot法檢測牛肺泡巨噬細胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB的蛋白表水平Fig.2 Proteins expression of TLR4,MyD88,IRAK4 and NF-κB in BAMs were analyzed by Western blotNote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

圖3 ELISA檢測牛肺泡巨噬細胞后上清液IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度Fig.3 Concentration of IL-6，IL-1β and TNF-α in supernatant were measured by ELISANote: PBS.Represents negative control.**.P<0.01 vs PBS.

2.2抵抗素上調牛肺泡巨噬細胞TLR4、MyD88、IRAK4和NF-κB蛋白表達 根據2.1中基因表達結果，采用免疫印跡法檢測100 ng/ml抵抗素誘導12 h后TLR4、MyD88、IRAK4、NF-κB蛋白表達水平。結果如圖2所示，與對照組相比，抵抗素可顯著誘導牛肺泡巨噬細胞上述蛋白表達(P< 0.01)，與基因檢測結果相符。

2.3抵抗素增加牛肺泡巨噬細胞IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放 采用ELISA試驗對100 ng/ml抵抗素處理后各時間點細胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子進行檢測，結果見圖3。抵抗素誘導牛肺泡巨噬細胞1.5 h后，IL-6、IL-1β和TNF-α濃度極顯著增高 (P< 0.01)，且表達量隨誘導時間增加而增加，IL-6、TNF-α在12 h達到峰值。

3 討論

抵抗素具有促炎效應，在炎癥的發生和進程中具有重要調控作用。研究發現，抵抗素在許多炎性疾病中扮演著重要角色，參與炎性疾病的發生和恢復，在動脈粥樣硬化[16]、關節炎[17]、全身炎癥反應綜合征[18]等炎性疾病過程中，均發現抵抗素處于高表達狀態。此外，抵抗素水平與IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子含量正相關[19,20]。Gao等[21]通過小鼠實驗發現抵抗素通過TLR4/NF-κB信號通路促進TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子表達增強冠狀動脈炎發展過程中的炎癥反應。Jiang等[22]也發現，在大鼠胰腺腺泡細胞中，抵抗素可激活NF-κB刺激促炎細胞因子TNF-α和IL-6的產生，加重胰腺炎損傷和風險。在本次研究中，發現牛肺泡巨噬細胞經抵抗素誘導后，NF-κB的mRNA表達量于6 h極顯著上調，Western blot 結果顯示其蛋白水平在12 h也顯著上調。通過檢測細胞上清發現，在該過程中抵抗素以時間依賴效應促進IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子表達釋放，IL-1β和TNF-α表達量于12 h 達到峰值。上述結果顯示抵抗素可促進牛肺泡巨噬細胞IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子表達，該過程可能與激活NF-κB有關。Toll樣受體是一類分布廣泛，表達于多種細胞中的天然免疫受體，可非特異性結合病原相關分子，啟動機體炎癥反應，在免疫防御中起著重要作用[23]。其中，TLR4是最早被發現，且研究最深[24]，不僅可識別大多數病原微生物，并激發機體天然免疫系統，在炎性疾病中也起著重要調控作用[25,26]。研究顯示，TLR4與抵抗素密切相關，且是抵抗素發揮促炎效應的潛在受體之一[27]。在動脈粥樣硬化過程中，抵抗素通過TLR4激活NF-κB誘導IL-6和TNF-α表達，促進外周血單個核細胞(PBMCs)的炎癥反應，加重疾病程度[28,29]。盡管抵抗素可通過TLR4發揮促炎作用，但其胞內信號傳導途徑卻鮮有報道。基于此，我們研究發現牛肺泡巨噬細胞經抵抗素誘導6 h后，TLR4及下游信號分子MyD88和IRAK4的mRNA水平均極顯著增加，12 h達到峰值，12 h TLR4、MyD88和IRAK4蛋白表達量較0 h均極顯著上調。因此推測，TLR4/MyD88依賴途徑可能是抵抗素發揮促炎作用的關鍵胞內信號通路之一。

綜上所述，抵抗素可誘導牛肺泡巨噬細胞釋放IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子，促進炎癥反應，且此過程可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號途徑有關，提示該信號通路可能是抵抗素發揮促炎作用的重要分子機制之一。本試驗初步探討了抵抗素促進牛肺泡巨噬細胞炎癥反應的分子機制，以期為肺部炎癥疾病的預防及治療提供新的方向和靶點。