IFN-γ對(duì)犬BMSCs增殖及分泌多種免疫抑制因子的影響①

李丹婷 黃曉雅 白利鵬 沈留紅 曹隨忠 余樹(shù)民

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是來(lái)自于具有異質(zhì)性的非造血部分的骨髓細(xì)胞群體，占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01%[1]。BMSCs具有高度增殖、自我更新及多向分化潛能，在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞等多類(lèi)細(xì)胞[1]。BMSCs不僅可以參與組織修復(fù)，而且可以減輕同種異體環(huán)境中的免疫排斥反應(yīng)，許多動(dòng)物和臨床研究均證實(shí)BMSCs在心血管病、移植物抗宿主病(Graft versus-host disease，GVHD)以及自身免疫性疾病方面的治療潛力[2]。BMSCs通過(guò)與多種免疫細(xì)胞的相互作用調(diào)節(jié)免疫功能，主要以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成為主，其誘導(dǎo)機(jī)制尚不完全清楚[3]，但已證實(shí)BMSCs可以通過(guò)與淋巴細(xì)胞直接接觸和分泌多種可溶性因子來(lái)發(fā)揮作用[4]，而激活其表面受體TLRs已經(jīng)被研究作為一種可能的手段來(lái)提高BMSCs的效力[5]。

近年來(lái)，BMSCs的免疫抑制特性調(diào)控炎癥發(fā)生與轉(zhuǎn)歸備受關(guān)注。IFN-γ和TNF-α是在多種損傷和病理情況下介導(dǎo)炎癥事件的重要促炎細(xì)胞因子。在體內(nèi)炎癥或移植病例中，BMSCs受這些因子的刺激，也引起B(yǎng)MSCs免疫調(diào)節(jié)活性的變化，據(jù)報(bào)道IFN-γ通過(guò)上調(diào)抑制性分子B7-H1來(lái)增強(qiáng)BMSCs的免疫抑制行為[6]，但是IFN-γ影響B(tài)MSCs作用機(jī)制和相關(guān)途徑尚不清楚。為進(jìn)一步探討IFN-γ對(duì)BMSCs免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)，本研究以犬BMSCs為材料，研究IFN-γ對(duì)BMSCs增殖、免疫抑制因子表達(dá)和分泌可溶性因子能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試動(dòng)物 6月齡左右健康中華田園犬6只，購(gòu)于四川省雅安市。

1.1.2主要試劑與儀器 LG-DMEM干粉培養(yǎng)基(Gibco公司)；FBS(HYclone公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；CD34、CD105、CD90抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、胰島素、IBMX、吲哚美辛，茜素紅、油紅O(Sigma分裝)；RT-qPCR試劑盒(TaKaRa公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；ELISA試劑盒(上海圓創(chuàng)生物科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備集團(tuán)有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、激光共聚焦顯微鏡(Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(CFX96TM，Bio-Rad 公司)。

1.2方法

1.2.1犬BMSCs的制備 取6月齡犬全身麻醉后，做無(wú)菌股骨穿刺，用肝素抗凝，抽取一定量骨髓液。用PBS充分洗滌2次，離心后棄上清液。將細(xì)胞沉淀直接用細(xì)胞培養(yǎng)液(LG-DMEM，15%FBS，1%青鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按108～109個(gè)/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。放置在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。待出現(xiàn)貼壁細(xì)胞集落后首次全量換液，換液后每3 d換一次培養(yǎng)液。待10～14 d細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度后用含0.25%胰酶-0.02%EDTA PBS溶液消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，傳至第3代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2犬BMSCs的免疫熒光檢測(cè)鑒定 取3代(P3)的細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種在24孔板，細(xì)胞達(dá)到 60%～80%匯合時(shí)按抗體說(shuō)明進(jìn)行CD34、CD90、CD105的免疫熒光檢測(cè)：貼壁細(xì)胞去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每次3 min，經(jīng)4%的多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次，加正常羊血清室溫封閉30 min，吸出血清，分別加入CD90(1∶50)、CD105(1∶50)、CD34(1∶100)，陰性對(duì)照以PBS當(dāng)作一抗。37℃過(guò)夜孵育，加入熒光二抗-FITC(1∶500)濕盒中20～37℃孵育1 h，在熒光顯微鏡下觀察，

1.2.3犬BMSCs體外向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定 取生長(zhǎng)良好的P4細(xì)胞，用胰酶消化后，以3×104個(gè)/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)分別換成成骨誘導(dǎo)液(10 nmol/L地塞米松，50 μmol/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10%FBS，LG-DMEM)和成脂誘導(dǎo)液(1 μmol/L地塞米松，10 mg/L胰島素，0.1 mmol/L IBMX，200 μmol/L 吲哚美辛，10%FBS，LG-DMEM)進(jìn)行分化誘導(dǎo)，每3 d換液一次。成骨分化誘導(dǎo)第21天用茜素紅進(jìn)行成骨細(xì)胞染色，鏡下觀察紅染的鈣結(jié)節(jié)并拍照記錄。成脂分化誘導(dǎo)14 d用油紅O進(jìn)行脂肪細(xì)胞染色，鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色的油滴并拍照記錄。

1.2.4CCK-8 法測(cè)定IFN-γ 刺激犬BMSCs后的增殖潛能 取P4細(xì)胞按4×103個(gè)/孔種入96孔板，貼壁后更換含有IFN-γ終濃度為10、20、50、100 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，以未刺激的同批次同代數(shù)的BMSCs作為對(duì)照。利用CCK-8試劑盒于IFN-γ刺激72 h后酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm處的吸光度值(A450 nm)。細(xì)胞增殖率與吸光度值呈正比。

1.2.5RT-qPCR 檢測(cè)IFN-γ預(yù)處理后的BMSCs中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá) 分別用含有IFN-γ終濃度為10、20、50、100 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs 72 h 后收集細(xì)胞，并以未刺激的同批次同代數(shù)的BMSCs 作為對(duì)照。用Trizol法細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作合成 cDNA。再利用 SYBR-green 法定量PCR 反應(yīng)試劑盒配制定量 PCR 反應(yīng)體系，于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀上，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase，GAPDH) 基因?yàn)閮?nèi)參基因，測(cè)定 BMSCs細(xì)胞內(nèi)吲哚胺 2-3 雙加氧酶 1(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO1)、IDO2、環(huán)氧合酶2(Cycloo-xygenase 2，COX2)、Toll樣受體3(TLR3)、TLR4等免疫抑制基因的表達(dá)情況，引物序列見(jiàn)表1。以未激活的BMSCs為對(duì)照組，目的基因的表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCT與內(nèi)參基因?qū)Ρ?ΔΔCt=CT 目的基因/CT內(nèi)參基因) ，對(duì)照組各基因表達(dá)量設(shè)為1。

1.2.6ELISA檢驗(yàn)IFN-γ預(yù)處理后的BMSCs中因子分泌情況 在6 cm2培養(yǎng)皿中加入含IFN-γ終濃度為10、20、50、100 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液激活培養(yǎng)BMSCs。72 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)1～2 d。取該條件培養(yǎng)液用0.22 mm濾膜過(guò)濾后用ELISA試劑盒測(cè)定犬尿氨酸、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、IL-10、TGF-β1、HGF的含量。以未激活的BMSCs細(xì)胞條件培養(yǎng)液作為對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1犬BMSCs的免疫熒光鑒定 原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞中可見(jiàn)有細(xì)胞集落形成，細(xì)胞分布不均勻，雜細(xì)胞較多；傳代培養(yǎng)后呈均一的梭形貼壁生長(zhǎng)，核質(zhì)比較大，平行狀或旋渦狀緊密排列，可見(jiàn)分裂相(圖1A、B) 。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)P3-P5細(xì)胞抗原>CD105和CD90，高強(qiáng)度熒光表達(dá)，均呈陽(yáng)性；CD34，熒光弱強(qiáng)度熒光表達(dá)，呈陰性(圖2)。

表1 GAPDH,IDO1、IDO2、TLR3、TLR4、COX2的引物序列

Tab.1 Primers of GAPDH, IDO1, IDO2,TLR3,TLR4,COX2

Gene IDPrimer sequence(5′-3′)Productlength (bp)GAPDHF:TCCCGCCAACATCAAA163R:TCACGCCCATCACAAACIDO1F:AGTCCGGGAGTTTGTTCGTTC298R:AAAATGTGCCCTTGTTTGAGTTACIDO2F:TGGCTTTATACTGGTGACTGTTTTG249R:GGCATTGCTGGGTTATCCTTTLR3F:TCTACCTTTCCTACAACAAATACCTACA211R:TTCTCAAGACCCTCCAACAGCTLR4F:GGGACAACCAGACTGAAGCATT166R:GGTAACGGAGGTTTCTGAGGGCOX2F:CCCATACAAGCACAATAGACGC102R:AAAGGATTCGGAGGGAAGGTA

圖1 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)特征(×100)Fig.1 Characteristics of canine bone marrow mesen-chymal stem cell culture(×100)Note: A.Primary (P0) cells；B.Third generation (P3) cells.

2.2犬BMSCs體外定向誘導(dǎo)分化鑒定

2.2.1生長(zhǎng)良好的P4細(xì)胞換成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)折光性強(qiáng)的空泡物質(zhì)，誘導(dǎo)分化14 d后，通過(guò)油紅O染色可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)染成橘紅色的脂肪顆粒(圖3A)，提示BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞。

2.2.2生長(zhǎng)良好的P4細(xì)胞換成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞變不規(guī)則樣，培養(yǎng) 21 d 后，細(xì)胞堆積成鈣化結(jié)節(jié)，通過(guò)茜素紅染色染成紅色(圖3B)，提示BMSCs可分化為成骨細(xì)胞。

2.3IFN-γ對(duì)犬BMSCs增殖潛能的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，添加梯度濃度的IFN-γ對(duì)BMSCs有增殖作用，且隨濃度的增加，增殖作用越強(qiáng)，但用100 ng/ml濃度的IFN-γ處理后，對(duì)BMSCs的增殖作用反而下降。

圖2 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原免疫熒光檢測(cè)(×200)Fig.2 Immunofluorescence detection of surface antigen of canine mesenchymal stem cells(×200)Note: A.Cell expression of CD105 in cells；B.Cells expressed CD90；C.Cells do not express CD34；D.Negative control.

圖3 誘導(dǎo)分化細(xì)胞染色后鏡檢(×100)Fig.3 Microscopic examination of induced differentiated cells after staining(×100)Note: A.Cells after adipogenic differentiation induced by oil red O staining;B.Cells after osteogenic differentiation induced by alizarin red staining.

2.4用IFN-γ處理對(duì)BMSCs表達(dá)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因與相關(guān)因子生成的影響

2.4.1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IFN-γ預(yù)刺激后BMSCs表達(dá)Toll樣受體(TLR)mRNA的情況 實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，未處理的 BMSCs不表達(dá)或低表達(dá)TLR3和TLR4 mRNA。IFN-γ處理后，BMSCs中 TLR3 mRNA 表達(dá)明顯升高，且具有劑量依賴(lài)性，用終濃度為50 ng/ml IFN-γ處理BMSCs，TLR3的表達(dá)最高(圖5A)；TLR4 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化(圖5B)。

2.4.2IFN-γ促進(jìn)BMSCs中 IDO mRNA表達(dá)和犬尿氨酸的分泌 實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，未處理的 BMSCs低表達(dá)IDO1和IDO2 mRNA。IFN-γ處理后，BMSCs 中 IDO1 mRNA 表達(dá)明顯升高，且具有劑量依賴(lài)性，用終濃度為IFN-γ 50 ng/ml處理BMSCs，IDO1的表達(dá)最高(圖6A)；IDO2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(圖6B)。

圖4 CCK-8法檢測(cè)犬BMSCs的增殖 Fig.4 CCK-8 method to detect proliferation of BMSCs in canineNote: Compared with the control group，*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖5 不同濃度IFN-γ處理BMSCs TLR3、TLR4 mRNA表達(dá)的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of BMSCs TLR3 and TLR4 mRNA expressions treated by IFN-γ inoculation at different concentrationsNote: *.P<0.05 vs 20 ng/ml group；**.P<0.01 vs control group.

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IFN-γ刺激后，BMSCs分泌的犬尿氨酸升高，有劑量依賴(lài)性(表2)。

2.4.3IFN-γ 抑制BMSCs的 COX2 mRNA表達(dá)和PGE-2的分泌 實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果顯示，IFN-γ處理后，BMSCs 中 COX2 mRNA 表達(dá)明顯降低，用終濃度為100 ng/ml IFN-γ處理BMSCs時(shí)，COX2 mRNA的表達(dá)量最低 ，與對(duì)照組相比差異極顯著(圖7)。

圖6 不同濃度IFN-γ處理BMSCs IDO1、IDO2 mRNA表達(dá)的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of BMSCs IDO1 and IDO2 mRNA expressions treated with IFN-γ inoculation at different concentrationsNote: **.P<0.01 vs control group；##.P<0.01 vs 20 ng/ml group.

IFN-γ(ng/ml)Kynurenine(ng/L)0434.5±6.50010473.0±5.0001)20512.5±3.5001)50583.0±5.0001)100611.0±4.0001)

Note：1)P<0.01 vs control group.

圖7 不同濃度IFN-γ處理BMSCs COX2 mRNA表達(dá)的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of BMSCs COX2 mRNA expression treated with IFN-γ at different concentrationsNote: *.P<0.05 vs control group；**.P<0.01 vs control group.

IFN-γ(ng/ml)PGE2(ng/L)0505.8±3.88510604.8±4.5352)20479.3±3.2401)50439.8±2.5902)100405.5±5.8252)

Note：1)P<0.05 vs 0 ng/ml group；2)P<0.01 vs 0 ng/ml group.

圖8 不同濃度IFN-γ對(duì)BMSCs分泌HGF、IL-10、TGF-β含量的影響Fig.8 Effects of IFN-γ in different concentration on BMSCs secretion of HGF,IL-10 and TGF-βNote: *.P<0.05 vs 0 ng/ml group；**.P<0.01 vs 0 ng/ml group.

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IFN-γ刺激后，10 ng/ml劑量組，BMSCs分泌的PGE2增加，其余組PGE2的分泌都受到顯著的抑制，且有劑量依賴(lài)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

2.5用IFN-γ處理對(duì)BMSCs分泌IL-10、HGF、TGF-β含量的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，IFN-γ刺激后，除了10 ng/ml劑量組外，其余組BMSCs分泌的HGF顯著增加，且有劑量依賴(lài)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8A)；除了100 ng/ml劑量組外，其余組BMSCs分泌的IL-10顯著增加，20 ng/ml劑量組極顯著地促進(jìn)了IL-10的分泌(圖8B)；除了20 ng/ml 劑量組外，50 ng/ml劑量組顯著抑制了TGF-β的分泌，10 ng/ml和100 ng/ml劑量組極顯著地抑制了TGF-β的分泌(圖8C)。

3 討論

本研究中，我們成功從正常犬骨髓中分離獲得BMSCs，并通過(guò)誘導(dǎo)多向分化，反映出該細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化潛能。雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在分化能力提高了人們對(duì)BMSCs的興趣，但另一方面它們的免疫支持能力也受到了臨床治療研究的關(guān)注。有研究表明IFN-γ對(duì)人和小鼠的BMSCs功能有顯著影響，IFN-γ刺激后，可以改變間充質(zhì)干細(xì)胞與增殖能力相關(guān)的miRNA表達(dá)水平，進(jìn)而影響間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力[7]。本研究驗(yàn)證了IFN-γ的添加，促進(jìn)了BMSCs的增殖潛能，并且具有濃度依賴(lài)性。但高濃度的IFN-γ刺激反而會(huì)降低BMSCs的數(shù)量。

通過(guò)前期文獻(xiàn)查閱，IFN-γ可以與細(xì)胞表面的TLR等受體結(jié)合調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)作用[8]。而TLR主要在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)，并識(shí)別保守的病原體衍生成分。TLR的連接激活多種先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答途徑，以消除和保護(hù)入侵病原體。BMSCs表面TLR被激活后(主要是TLR3、TLR4)，可以特異性增強(qiáng)對(duì)Treg的誘導(dǎo)，提高細(xì)胞免疫抑制功能[9,10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明IFN-γ刺激BMSCs后主要是通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面TLR3的表達(dá)而非TLR4，從而發(fā)揮作用。參考前期文獻(xiàn)資料顯示，經(jīng)TLR啟動(dòng)的BMSCs能分別極化為不同表型的BMSCs1和BMSCs2，觀察后發(fā)現(xiàn)由TLR4啟動(dòng)的BMSCs——BMSCs1有促炎調(diào)節(jié)作用，而由TLR3啟動(dòng)的BMSCs——BMSCs2表現(xiàn)更多的是免疫抑制[11]。由本結(jié)果推測(cè)IFN-γ的刺激可能激活TLR3信號(hào)通路。

與此同時(shí)，TLR介導(dǎo)的免疫抑制作用依賴(lài)于色氨酸降解酶IDO產(chǎn)生的免疫抑制性犬尿氨酸。而IDO分為IDO-1和IDO-2兩個(gè)亞型，其中IDO-1 具有負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的能力，能夠預(yù)防急性移植排斥反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果驗(yàn)證，IFN-γ的刺激可能主要增強(qiáng)了IDO-1的表達(dá)而促進(jìn)了BMSCs的免疫抑制作用能力，并具明顯的劑量依賴(lài)性，而IDO-2在這個(gè)過(guò)程中起的作用較小。 經(jīng)ELISA檢測(cè)BMSCs分泌的犬尿氨酸的表達(dá)量也隨IFN-γ出現(xiàn)顯著地增加，繼而可能影響T細(xì)胞的增殖或促使初始T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化[13]，負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答。

BMSCs 介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用也是多種可溶性因子參與的結(jié)果，已有報(bào)道的可溶性因子包括TGF-β、HGF、IL-2和 IL-10、一氧化氮(Nitric oxide，NO)以及PGE2[14-16]。在本研究中，IFN-γ處理后的BMSCs所分泌的HGF和IL-10都有一定程度的增加。其中，IL-10 是 Treg 細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，Treg 通過(guò)分泌 IL-10 抑制 Th1 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、Th2介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生和 CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化[17]；HGF則主要是誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D2的減少和增加p27kip1在T細(xì)胞中表達(dá)，最終導(dǎo)致G1細(xì)胞增殖停滯階段從而T細(xì)胞的增殖得到抑制[18]。說(shuō)明本試驗(yàn)用IFN-γ處理BMSCs后一定程度上提高了其分泌抑炎因子的能力。而 TGF家族分子是多效性細(xì)胞因子，在癌癥、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合中具有重要作用。在之前的研究中TGF-β也發(fā)揮抗炎作用，抑制T細(xì)胞增殖。但在Xu等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)，與其已確立的免疫抑制作用相反，BMSCs和活化T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，TGF-β逆轉(zhuǎn)了BMSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs分泌這種因子，但在刺激下，TGF-β的分泌出現(xiàn)較明顯的下降，其對(duì)于免疫抑制的作用還有待進(jìn)一步的研究。

另外比較有趣的發(fā)現(xiàn)是，PGE2是重要的細(xì)胞生長(zhǎng)和炎癥介質(zhì)，是COX-2的代謝產(chǎn)物，擁有免疫調(diào)節(jié)功能。有研究證明BMSCs中PGE2的分泌有時(shí)間依賴(lài)性，在培養(yǎng)4～5 d后下降，在MLR早期(48 h)PGE2起到抑制作用[19]。在本研究中顯示，在IFN-γ刺激下，PGE2的分泌量是在作用72 h時(shí)間點(diǎn)所測(cè)的，COX-2的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的降低且PGE2的分泌量在大劑量作用下分泌降低，其中作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，IFN-γ對(duì)BMSCs的增殖能力有一定促進(jìn)作用，并且能夠誘導(dǎo)BMSCs免疫抑制因子表達(dá)，提高分泌可溶性因子能力。本試驗(yàn)證明IFN-γ主要通過(guò)激活TLR3胞內(nèi)通路作為BMSCs有效的刺激因子，在一定程度上有促進(jìn)BMSCs免疫抑制能力的潛力。同時(shí)也通過(guò)刺激后提高體外培養(yǎng)BMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力對(duì)于提高細(xì)胞治療效力、減少不良反應(yīng)、降低治療成本等臨床應(yīng)用具有重要意義。本研究希望為BMSCs應(yīng)用于臨床輔助治療避免免疫紊亂做有益的探索。