蘆丁對人肺癌A549/DDP細胞耐藥性的逆轉作用及其機制

孔祥虎 李志欣 房麗君 焦建峰

(包頭市腫瘤醫院，包頭 014030)

肺癌是威脅我國居民健康的主要惡性腫瘤之一。我國每年新增肺癌患者約733.3萬例，每年死于肺癌者達610.2萬例，發病率和死亡率居惡性腫瘤譜第一位[1]。由于多數肺癌患者在確診時已為晚期，失去了手術治療的最佳時機，放療和化療成為主要的治療手段。盡管大多數肺癌患者對初始化療敏感，但化療耐藥性的產生是其療效下降的主要原因[2]。因此，如何逆轉化療耐藥性成為肺癌治療中亟待解決的問題之一。蘆丁(Rutin,RT)，又名蕓香苷，是從蕓香葉中提取的一種黃酮苷類化合物。近年來研究顯示，可通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，以及逆轉腫瘤耐藥性發揮抗腫瘤活性[3-7]。但目前國內外尚未見RT對肺癌順鉑(Cisplatin,DDP)耐藥性的逆轉作用的報道。本研究擬通過分子生物學方法探究RT對人肺癌A549/DDP細胞順鉑耐藥性的影響及其分子機制。本研究有望為RT治療肺癌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞A549和順鉑耐藥株A549/DDP購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；RT(100 mg/支，純度>97.1%)、IκB激酶(IκB kinase，IKK)抑制劑IKK16(10 mg/支，純度>99%)和DDP(50 mg/支，純度>99%)購自美國Selleck公司；胎牛血清和RPMI-1640培養液購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；Trizol試劑、RIPA裂解液和ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；實時定量PCR反應(RT-PCR)試劑盒購自大連寶生物公司；兔抗人IKKα、p-IKKα(Ser176)、p65、p-p65(Ser536)、多藥耐藥相關蛋白1(Multidrug resistance associated protein 1,MRP1)、谷胱甘肽S轉移酶-π(Glutathione S transferase-π,GST-π)、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，A549/DDP細胞用含10%胎牛血清和1 mg/L DDP的RPMI1640培養液，在37℃、5%CO2條件下培養；當細胞覆蓋率達到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數生長期A549細胞和A549/DDP細胞，以每孔5 000個接種于96孔板；常規培養24 h后，實驗孔分別加入100 μl含不同濃度RT和/或DDP的細胞培養液，同時設調零孔和對照孔，每組設5個復孔；培養48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度A值；計算細胞活力細胞活力=[(實驗組A值-調零組A值)/(對照組A值-調零組A值)]×100%；使用SPSS16.0軟件的Probit回歸模型計算藥物的半數抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)，并計算出耐藥倍數與逆轉倍數。耐藥倍數=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50，逆轉倍數=耐藥細胞IC50/RT作用下IC50。實驗重復3次。

1.2.3藥物聯合應用評價 采用Chou-Talalay中效分析法對CCK-8法檢測結果進行分析；中效方程式為：Fa/Fu=(D/Dm)m，其中Fa為抑制率，Fu=1-Fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率；依據中效方程式計算不同效應的藥物聯合指數(Combination index，CI)，CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)，其中DX1、DX2為兩藥單用產生X效應時各自所需濃度，D1、D2為兩藥聯用產生X效應時各自所需濃度；應用CompuSyn 1.0軟件計算出不同Fa下的CI值，并繪制出Fa-CI曲線，若CI<1，認為兩藥為協同作用，CI=1為相加作用，CI>1為拮抗作用。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期A549/DDP細胞，實驗分為4組：對照組、RT組、DDP組、RT+DDP組，其中RT和DDP的終濃度分別為40 μmol/L和8 μmol/L；藥物作用48 h后，收集各組細胞，PBS洗滌2次，先加入200 μl結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應15 min，用流式細胞儀分析檢測。實驗重復3次。

1.2.5Western blot印跡法檢測蛋白水平 取對數生長期A549/DDP細胞，實驗分為4組：對照組、RT組、IKK16組、RT+IKK16組，其中RT和IKK16的終濃度分別為40 μmol/L和8 μmol/L；藥物作用48 h后，收集各組細胞，用RIPA裂解細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，暗室X膠片顯影，拍照，使用Image J1.45s軟件進行灰度分析。以目標蛋白與內參β-actin的灰度比作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.6RT-PCR檢測mRNA水平 細胞處理同1.2.5，收集各組細胞，用Trizol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA進行反轉錄反應，反轉錄條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。取2 μl上述反應液進行PCR，PCR反應條件：94℃ 1 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環。MRP1上游引物：5′-TGCTCACTTTCTGGCTGGTA-3′，下游引物：5′-TAGGGT-CGTGGATGGTTTCC-3′；GST-π上游引物：5′-CTTGGGCTCTATGGGAAGGA-3′，下游引物：5′-GACAGCAGGGTCTCAAAAGG-3′；GAPDH上游引物：5′-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3′，下游引物：5′-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3′。取5 μl擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照，用ImageJ1.45s軟件進行灰度分析，以目的產物與內參GAPDH的灰度值比值表示目的基因mRNA的相對表達水平。實驗重復3次。

2 結果

2.1細胞活力的變化 如圖1A所示，與對照組相比，2～16 μmol/L DDP組A549細胞活力均顯著下降(P<0.05)，且隨著DDP劑量的增加呈下降趨勢，IC50為4.95 μmol/L。如圖1B所示，與對照組相比，不同劑量DDP組或RT組A549/DDP細胞活力均顯著下降(P<0.05)，且隨著DDP或RT劑量的增加逐漸下降，IC50分別為37.08 μmol/L和524.40 μmol/L；當兩種藥物按1∶10聯合作用時，A549/DDP細胞活力顯著低于相同濃度的DDP組(P<0.05)，藥物聯合的IC50為175.39 μmol/L，其中DDP和RT的濃度分別為15.94 μmol/L和159.45 μmol/L。由此可知，A549/DDP細胞對DDP的耐藥倍數為7.49，而RT提高A549/DDP細胞對DDP的敏感性，逆轉倍數為2.33。

2.2DDP與RT聯合效應分析 采用Chou-Talalay中效分析法依據CCK-8法檢測結果計算出不同Fa下的CI值，并繪制出Fa-CI曲線。如圖2所示，當Fa>0.09時，CI<1，兩藥合用產生協同效應。這表明RT可協同增強DDP對A549/DDP細胞的抑制作用。

圖1 DDP和RT對A549和A549/DDP細胞活力的影響Fig.1 Effect of DDP and RT on cell viability in A549 and A549/DDP cellsNote: A.A549 cells;B.A549/DDP cells;*.P<0.05 versus DDP 0 μmol/L group;#.P<0.05 versus DDP group at the same concentration.

圖2 藥物聯合指數(CI)與抑制率(Fa)曲線圖Fig.2 Graph of CI and fraction affected (Fa)Note: CI>1 stands for antagonistic effect;CI<1 stands for synergistic effect.

2.3DDP與RT對A549/DDP細胞凋亡的影響 如圖3所示，與對照組相比，RT組細胞凋亡率的變化無統計學差異(P>0.05)，而DDP組和RT+DDP組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；同時，RT+DDP組細胞凋亡率顯著高于DDP組(P<0.05)。

2.4RT對IKKα和p65蛋白磷酸化的影響 如圖4所示，與對照組相比，RT組、IKK16組和RT+IKK16組細胞中IKKα和p65蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；同時，RT+IKK16組細胞中IKKα和p65蛋白磷酸化水平顯著低于RT組(P<0.05)。

圖3 DDP和RT對A549/DDP細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of DDP and RT on apoptosis in A549/DDP cellsNote: A.Apoptosis detection;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

圖4 RT對A549/DDP細胞IKKα和p65蛋白磷酸化的影響Fig.4 Effect of RT on phosphorylation of IKKα and p65 in A549/DDP cellsNote: A.Western blot assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

圖5 RT對A549/DDP細胞MRP1和GST-π蛋白表達的影響Fig.5 Effect of RT on protein levels of MRP1 and GST-π in A549/DDP cellsNote: A.Western blot assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

圖6 RT對A549/DDP細胞MRP1和GST-π的mRNA表達水平的影響Fig.6 Effect of RT on mRNA levels of MRP1 and GST-π in A549/DDP cellsNote: A.RT-PCR assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus RT group.

2.5RT對MRP1和GST-π蛋白表達的影響 如圖5所示，與對照組相比，RT組、IKK16組和RT+IKK16組細胞中MRP1和GST-π蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；同時，RT+IKK16組細胞中MRP1和GST-π蛋白表達水平顯著低于RT組(P<0.05)。

2.6RT對MRP1和GST-π的mRNA表達水平的影響 如圖6所示，與對照組相比，RT組、IKK16組和RT+IKK16組細胞中MRP1和GST-π的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；同時，RT+IKK16組細胞中MRP1和GST-π的mRNA表達水平顯著低于RT組(P<0.05)。

3 討論

RT是廣泛存在于多種植物包括蕓香、番茄、蕎麥、煙草和連翹等的一種黃酮醇配糖體，具有抗炎、抗病毒、抗氧化和降血壓等藥理作用[8-10]。近年來，RT的抗腫瘤作用逐漸受到關注。Nafees等[3]研究證實，RT可通過下調Bcl-2/Bax蛋白比值以及激活p38信號通路誘導結腸癌HT-29細胞凋亡。Elsayed等[5]研究表明，RT通過下調c-Met蛋白磷酸化水平抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲。RT還可通過抑制P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表達逆轉乳腺癌MCF-7/耐阿霉素(Adriamycin，ADR)細胞耐藥性[11]。本研究顯示，RT可與DDP協同抑制A549/DDP細胞活力，并增強DDP誘導的A549/DDP細胞凋亡，這表明RT可逆轉A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。

腫瘤細胞內藥物積累量的減少是耐藥性產生的重要原因之一，而化療藥物外排主要由ATP 結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運體介導。DDP在細胞質中水解后容易與胞內含硫分子結合形成復合物，該復合物可由MRP1(即ABCC1)泵出腫瘤細胞，導致DDP耐藥性的產生[12]。Lan等[13]研究證實，外源性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)可通過抑制MRP1和GST-π表達提高肺癌A549細胞對DDP的敏感性。Fang等[14]研究顯示，抑制STAT3活化可下調MRP1和P-gp表達以逆轉A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。本研究顯示，RT和IKK16均可下調MRP1的mRNA和蛋白表達水平，且兩者聯用時抑制作用增強。上述研究表明，MRP1表達量升高與肺癌細胞DDP耐藥性的產生關系密切，而RT可通過抑制IKKα/p65信號通路下調MRP1表達。

GST-π可催化GSH與DDP的結合反應，這使得DDP無法進入細胞核與靶點DNA結合，從而產生DDP耐藥性[15]。Zhao等[16]研究顯示，上調GST-π表達可降低宮頸癌SiHa細胞對DDP的敏感性。Lin等[17]研究證實，敲除GST-π可抑制肺癌A549/DDP細胞增殖和遷移，并逆轉其DDP耐藥性。本研究顯示，RT和IKK16均可抑制GST-π蛋白和mRNA的表達，且兩者聯用時抑制作用更強。這表明，RT可通過抑制IKKα/p65信號通路下調GST-π表達，由此逆轉A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。

由p50和p65形成的異型二聚體是哺乳動物細胞中最常見的NF-κB蛋白。在細胞質中，NF-κB通常與IκB結合而以無活性狀態存在?；罨腎KKα可磷酸化IκB導致其降解，同時磷酸化p65促進其進入細胞核，進而調控靶基因的表達[18]。Ma等[19]研究顯示，抑制NF-κB信號通路可下調MRP1和P-gp蛋白表達，從而增強人T淋巴瘤Jurkat和HuT-78細胞對DDP的敏感性。敲除p65會導致乳腺癌阿霉素(Doxorubicin,Dox)耐藥株MCF-7/Dox細胞中MDR1和P-gp蛋白表達水平降低[20]。Zhou等[21]研究證實，抑制NF-κB信號通路可通過下調MRP1和GST-π蛋白表達逆轉A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。本研究表明，抑制IKKα/p65信號通路可在轉錄水平抑制A549/DDP細胞中MRP1和GST-π表達。

綜上所述，RT可在體外增強DDP對人肺癌A549/DDP細胞的毒性作用，這可能與其抑制IKKα和p65蛋白磷酸化，進而下調MRP1和GST-π的mRNA和蛋白表達水平有關。