ERβ激動劑對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的保護作用及機制研究①

肖美芳 陸 喆 王 敏 李 玲

(海南省婦幼保健院檢驗科,海口 571206)

多發性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統自身免疫性疾病，主要特征為中樞神經系統內脫髓鞘和小血管周圍單核細胞浸潤，在中青年人群中多發，多數患者經歷復發緩解、然后繼發進展階段，從而導致中樞神經系統損傷不可恢復[1]。該病的病因尚不清楚，主要集中在調節免疫反應上。有研究顯示雌激素及其受體在腦脊髓組織中發揮重要作用，雌激素可有效治療老年癡呆癥、帕金森病、癲癇等神經系統疾病，雌激素主要通過雌激素受體發揮作用[2,3]，發現ERα是雌激素發揮中樞神經保護作用的關鍵受體[4]，Moore等[5]研究發現ERβ激動劑通過促進髓鞘的形成發揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyeli-tis，EAE)小鼠動物模型的治療作用。本文對ERβ激動劑對EAE小鼠的保護作用及其對小膠質細胞活化和氧化應激的影響進行研究，探討ERβ激動劑對EAE小鼠的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 4周齡90只健康雌性C57BL/6小鼠、體重18～21 g、購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2007-0001。

1.1.2主要試劑 DPN(美國Santa Cruz公司)，二甲基亞砜、完全弗氏佐劑、免疫組化試劑盒、羊抗小鼠Iba-1抗體、兔抗小鼠iNOS抗體、兔抗羊IgG-HRP多聚體、山羊抗兔IgG-HRP多聚體(美國Sigma公司)，卡介苗(中國藥品生物制品檢定所)，髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)35-55多肽(西安美聯多肽合成有限公司)，百日咳毒素(成都生物制品研究所)，MDA檢測試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1小鼠雙側卵巢切除術 將每只小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部兩側各行2 cm左右切口，將輸卵管組織連同脂肪組織一起結扎，剪除卵巢組織，縫合傷口，2周后建立EAE小鼠模型。

小鼠分組：將90只小鼠隨機分成對照組、模型組和DPN組，每組30只。

1.2.2EAE小鼠模型建立及處理 模型組和DPN組小鼠建立模型：用PBS稀釋MOG35-55濃度為300 μg/ml，與等量完全弗氏佐劑混合，用注射器抽打呈油包水狀態抗原乳劑，每只小鼠分別于免疫0 d和7 d在小鼠頸部、背部、腋窩、膝部皮下注射抗原乳劑0.2 ml，免疫0 d、2 d腹腔注射0.4 mg百日咳毒素，制備實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型；對照組小鼠于免疫0 d和7 d在小鼠頸部、背部、腋窩、膝部皮下注射等量PBS液，免疫0 d、2 d腹腔注射等量生理鹽水、DPN組小鼠于免疫當日起皮下注射0.5 ml DPN(根據小鼠體重，按30 nmol/100 g計算DDN的量，并溶解于0.5 ml 二甲基亞砜中)，每周2次，共3周；對照組和模型組小鼠同樣方法皮下注射等量二甲基亞砜。

1.2.3臨床癥狀評分 各組小鼠自免疫當天起每天早晚稱重，觀察小鼠運動、攝食、發病情況直至小鼠被處死，采用雙盲法進行神經功能缺損評分：其評分標準為尾巴無異常為0分，尾巴半癱為1分，尾巴全癱為2分；四肢：無異常為0分，步態改變為1分，輕度癱瘓為2分，全癱為3分，四個肢體分別進行評分，并累加；死亡為15分。

1.2.4各組小鼠腰髓HE染色 每組取10只小鼠，免疫3周后處死，取腰髓組織經多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成厚5 μm切片進行常規HE染色，根據光學顯微鏡下炎癥細胞浸潤程度進行炎癥反應評分，評分標準為：沒有炎癥反應為0分，炎癥細胞浸潤局限在軟脊膜和血管周圍為1分，脊髓內炎癥細胞浸潤為1～10個/視野為2分，脊髓內炎癥細胞浸潤為11～100個/視野為3分，脊髓內炎癥細胞浸潤>100個/視野為4分。每張切片取6個高倍視野的平均值。

1.2.5小膠質細胞活化標志物Iba-1和iNOS蛋白表達測定 每組取10只小鼠，采用免疫組織化學法測定小鼠腦組織Iba-1和iNOS蛋白表達情況：將小鼠腦組織切片常規脫蠟脫水，H2O2滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸鹽修復抗原，血清封閉，加入羊抗小鼠Iba-1一抗和兔抗小鼠iNOS一抗，過夜孵育，滴加二抗：兔抗羊IgG-HRP多聚體(Iba-1)、山羊抗兔IgG-HRP多聚體(iNOS)孵育20 min，DAB顯色，常規脫水、透明、封片，光鏡下觀察Iba-1和iNOS陽性細胞數，每張切片選5個400倍高倍視野計算平均陽性細胞數。腦組織MDA含量測定：每組取10只小鼠處死取腦組織，采用比色法測定腦組織MDA含量。

2 結果

2.1各組小鼠發病情況及臨床癥狀評分比較 對照組小鼠活動正常，未出現神經功能缺損臨床癥狀，體重正常增長；模型組30只小鼠均發病，最早臨床癥狀出現在免疫后10 d，發病小鼠臨床癥狀為活動量減少、食欲下降、體重減輕，毛色暗淡，尾部遠端張力下降、尾部癱瘓，后肢無力、甚至癱瘓，嚴重者出現前肢癱瘓、瀕臨死亡等；DPN組30只小鼠18只出現臨床癥狀，剩下12只未發病。DPN組小鼠臨床癥狀評分[(1.52±0.34)分]明顯低于模型組[(3.24±0.64)分](t=13.000，P=0.000)。

2.2各組小鼠HE染色及炎癥反應評分比較 對照組小鼠腰髓HE染色未見明顯異常，無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠腰髓實質內可見大量以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤；DPN組小鼠見少量炎性細胞浸潤。DPN組小鼠腰髓炎癥反應評分[(1.32±0.65)分]低于模型組[(4.21±0.87)分](t=8.415，P=0.000)。見圖1。

2.3各組小鼠小膠質細胞活化情況比較 與對照組比較，模型組和DPN組小鼠小膠質細胞活化標志物Iba-1陽性細胞增多(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠Iba-1陽性細胞減少(P<0.05)。光鏡下可見對照組小鼠脊髓實質內少量小膠質細胞，小膠質細胞的分枝樣突起細小；模型組小鼠脊髓實質內小膠質細胞增多，突起較對照組明顯，染色加深，呈“阿米巴”狀；DPN組小鼠脊髓實質小膠質細胞較模型組明顯減少。見表1和圖1。

圖1 各組小鼠腦組織HE染色和免疫組化染色Fig.1 HE staining and immunohistochemical staining of brain tissue of mice in each groupNote: A.Brain tissue HE staining(×40)；B.Brain tissue microglia activation immunohistochemical staining (×400)；C.Brain tissue iNOS immunohistochemical staining (×400).

表1 各組小鼠Iba-1陽性細胞數、iNOS陽性細胞數、MDA含量比較(n=10)

Tab.1 Comparison of number of Iba-1 positive cells,iNOS positive cells and MDA content in each group of mice(n=10)

GroupsNumber of Iba-1positive cells(cells)Number of iNOSpositive cells(cells)MDA contentControl group6.13±1.2713.24±2.531.37±0.32Model group20.04±3.5262.71±9.243.41±0.58DPN group13.62±2.1427.38±6.472.16±0.28F8.027145.74461.371P0.0000.0000.000

2.4各組小鼠腦組織iNOS蛋白表達比較 對照組小鼠腦組織有少量iNOS蛋白陽性細胞，模型組小鼠腦組織iNOS蛋白陽性細胞明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，模型組和DPN組小鼠腦組織iNOS蛋白陽性細胞數升高(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠腦組織iNOS蛋白陽性細胞數降低(P<0.05)。見表1和圖1。

2.5各組小鼠MDA含量比較 與對照組比較，模型組和DPN組小鼠MDA含量升高(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠MDA含量降低(P<0.05)。見表1。

2.6腦組織中Iba-1蛋白陽性細胞數與iNOS蛋白陽性細胞數相關性 腦組織中Iba-1蛋白陽性細胞數與iNOS蛋白陽性細胞數呈正相關(r=0.623，P<0.001)。

3 討論

MS是中樞神經系統自身免疫性脫髓鞘疾病，病變累及大腦半球白質、脊髓、視神經、腦干以及小腦，病理特征為局灶性脫髓鞘、炎癥反應、軸索受損、神經功能損傷，EAE與MS的組織病理學特征和免疫學特征相似[6，7]，是MS最有價值的疾病模型。

雌激素可有效緩解女性多發性硬化的病情，對MS具有神經保護作用，其作用機制可能為雌激素通過與ER元件作用，促進下丘腦-垂體-腎上腺軸釋放糖皮質激素，協同雌激素抑制MS；另外雌激素可直接與ER發揮免疫調節作用[8，9]。ER有ERα和ERβ兩種類型，研究發現這兩種受體在中樞神經系統保護中發揮不同的調控作用，大量研究發現ERα可通過減輕炎癥反應、調節T細胞活性等發揮對中樞神經系統的保護作用[10，11]。Lee等[12]研究發現小膠質細胞表達ERβ，小膠質細胞的ERβ是人參皂甙發揮神經元保護作用的基礎；Hidalgo-Lanussa等[13]研究發現替勃龍通過ERβ減輕小膠質細胞的氧化損傷和炎癥反應；Moore等[5]研究認為ERβ激動劑吲唑氯化物可通過刺激內源性髓鞘形成發揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的治療作用。本研究發現ERβ激動劑DPN治療EAE小鼠可改善小鼠神經功能缺損評分，減輕中樞炎癥反應，表明ERβ激動劑DPN對EAE小鼠中樞神經具有保護作用。

小膠質細胞是中樞神經系統的免疫細胞，具有產生促炎因子、抗原呈遞等功能[14]，小膠質細胞的激活與EAE的炎癥損害關系密切，小膠質細胞受到刺激后變為激活狀態，形態上體積變大、胞體變圓，具有吞噬和變形作用[15，16]；功能上可大量表達炎癥因子、抗原提呈和識別有關的特異性膜表面分子，啟動免疫反應，還可釋放活性氧族，生成大量iNOS，通過“呼吸爆發”現象產生大量的氧自由基，造成脂質過氧化，發生氧化應激損傷，加重炎癥反應，最終引起脫髓鞘和中樞神經系統其他病理損傷[17,18]。iNOS蛋白表達程度與實驗性自身免疫性腦脊髓炎的損害嚴重程度有關，iNOS陽性細胞在疾病發展過程中主要在脊髓實質內壞死組織中表達，參與髓鞘脫失和組織損傷過程[19，20]。本研究結果發現EAE小鼠腦組織中小膠質細胞活化標志物Iba-1陽性細胞和iNOS陽性細胞數量明顯增加，而ERβ激動劑DPN干預后小鼠腦組織中小膠質細胞活化標志物Iba-1陽性細胞和iNOS陽性細胞數量顯著減少，表明ERβ激動劑DPN通過抑制小膠質細胞活化、降低iNOS介導的炎癥反應發揮對EAE小鼠的神經保護作用。本文還發現腦組織活化小膠質細胞數量與iNOS蛋白呈正相關，表明降低iNOS介導的炎癥反應可能與小膠質細胞的活化有關。

EAE發生的氧化應激可引起髓鞘脫失、神經元和軸索損傷等，從而引起病理損害，MDA是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的產物之一，可以反映機體脂質過氧化反應以及氧化應激程度，在機體受到外界刺激或病理條件下，氧化-抗氧化平衡被破壞，體內過剩的氧自由基可以使多不飽和脂肪酸中的不飽和鍵氧化，引起脂質過氧化反應，脂質過氧化反應的最終產物MDA對細胞膜和細胞器等結構有嚴重的損害作用[21，22]。本研究發現EAE小鼠腦組織中MDA含量升高，而ERβ激動劑DPN干預后小鼠腦組織中MDA含量減少，表明ERβ激動劑DPN可通過減輕腦組織氧化應激損傷，從而發揮對EAE小鼠的神經保護作用。

綜上所述，ERβ激動劑DPN干預對EAE小鼠具有神經保護作用，其機制可能與小膠質細胞活化和氧化應激反應有關。