槲皮苷對免疫功能低下小鼠的免疫調節(jié)作用①

陳龍云 周艷艷 徐安莉 趙 敏 黃 敏 陳會敏

(湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430000)

槲皮苷(Quercitrin，QI)作為天然黃酮苷化合物具有廣泛的藥理活性，不僅在抗心腦血管疾病、神經保護及調血脂等方面具有良好藥理活性[1]，而且還具有抗過敏、抗氧化、止咳平喘、抗血小板聚集、降血糖和抗腫瘤等作用[2]。槲皮苷在自然界分布廣泛且含量豐富，具有多種活性而又幾乎無毒副作用，是非常有潛力的天然先導化合物。然而國內外關于槲皮苷針對免疫低下機體的免疫功能的影響相關研究較少。劉曉巖等[3]研究表明槲皮苷可能通過一氧化氮及免疫調節(jié)機制對睡眠剝奪大鼠的睡眠產生積極影響，同時也可對正常大鼠進行免疫調節(jié)。本實驗采用實驗性免疫抑制小鼠為模型，探討槲皮苷對免疫抑制小鼠免疫功能的影響并研究其作用機制，為其在增強免疫低下人群的免疫功能及治療相關疾病方面提供科學支持。

1 材料與方法

1.1材料 環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)購自上海源葉生物，雞紅細胞購自武漢純度生物，槲皮苷均購自美國Sigma公司;IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、CAT等ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)；細胞ROS檢測試劑盒、BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；CD4-FITC、CD8-PE antimouse單抗購自BioLegend公司；蛋白Marker購自北京全式金生物技術有限公司；小鼠單抗β-actin、HRP標記羊抗兔二抗、兔多抗NF-κB p65、兔多抗TLR2均購自Affinity公司；6周齡BALB/c小鼠購自武漢大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(鄂)2018-0003。

流式細胞儀(CytoFLEX，美國Beckman Coulter公司)；倒置顯微鏡(IX51，中國OLYMPUS公司)；低速離心機(5702R，德國Eppendorf公司)；酶標儀(Multi skan MK3，美國Thermo Scientific 公司)；凝膠電泳系統(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀 (BioSpectrum，美國UVP公司)。

1.2方法

1.2.1造模與給藥 50只BALB/c小鼠體重18～22 g，雌雄各半，隨機分為對照組、模型組(200 mg/kg)、槲皮苷低劑量組(20 mg/kg)、槲皮苷中劑量組(50 mg/kg)和槲皮苷高劑量組(80 mg/kg)(給藥劑量參考Li及劉珊珊等[4,5]的研究)，每組10只。于恒溫(22～26℃)、恒濕(42%～65%)條件下適應性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。7 d后模型小鼠均一次性腹腔注射CTX 200 mg/kg，對照組注射等體積生理鹽水；槲皮苷低劑量組(20 mg/kg)、槲皮苷中劑量組(50 mg/kg)和槲皮苷高劑量組(80 mg/kg)均第2天開始灌胃給藥，對照組及模型組每天灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)治療14 d。

1.2.2稱重法測定小鼠免疫器官指數 末次給藥24 h后處死小鼠，立即稱小鼠體重；無菌條件下迅速取出脾臟和胸腺器官洗凈并稱重，根據以下公式計算脾指數和胸腺指數。脾臟指數%=[脾臟重量(g)/小鼠體重(g)]×100%；胸腺指數%=[胸腺重量(g)/小鼠體重(g)]×100%。

1.2.3Giemsa染色法檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能 小鼠末次給藥后腹腔注射0.5 ml生理鹽水(含1%雞紅細胞)，輕揉小鼠腹部使雞紅細胞分散。1 h后處死小鼠，暴露腹膜并注入200 μl PBS，反復混勻后吸取腹腔液均勻涂片，置于濕盒中37℃孵育，30 min后用生理鹽水洗去未吸附雞紅細胞，丙酮-甲醇溶液固定5 min，Giemsa液染色15 min后鏡檢，每片計數200個巨噬細胞，按照以下公式計算吞噬百分率和吞噬指數。

吞噬百分率%=(吞噬雞血紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數)×100%；吞噬指數%=(被吞噬的雞血紅細胞總數/計數的巨噬細胞數)×100%。

1.2.4ELISA測定小鼠血漿IgG、IgM、IL-2及IL-4水平 各實驗組眼眶取血，低溫高速離心取血漿。根據相應ELISA試劑盒說明書進行小鼠血漿IgG、IgM、IL-2及 IL-4含量的測定。

1.2.5流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞亞群 頸脫臼處死小鼠，無菌條件下取脾臟，經過研磨并過濾制成單細胞懸液，RPMI1640洗滌，以3 000 r/min的轉速離心1 min，棄上清，加2 ml紅細胞裂解液，室溫靜置3 min使紅細胞完全裂解，然后再以3 000 r/min離心1 min，棄上清，以RPMIl640培養(yǎng)基洗滌并重復離心1次，得細胞沉淀制作小鼠脾細胞混懸液(1×107個/ml)，各流式檢測管中分別加入100 μl，再分別加入FITC-CD4、PE-CD8抗體各2 μl，振蕩混勻后4℃避光靜置30 min；PBS洗滌，離心2次，棄上清，再加入PBS重懸細胞后上機檢測，Flow Jo軟件分析。

1.2.6小鼠免疫器官組織學觀察 脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺、脾臟，以波恩固定液固定。組織依次用75%、85%、90%、95%及無水乙醇進行組織脫水，以二甲苯進行透明處理，后以60℃石蠟缸進行浸蠟，再進行石蠟包埋并切片，然后脫蠟，蘇木素-伊紅染色，1%的鹽酸酒精分化，中性樹膠封片，最后光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7流式細胞術檢測小鼠脾臟細胞ROS水平 小鼠脾細胞懸液(1×107ml-1)各取100 μl加入到流式檢測管，按照DCFH-DA細胞ROS檢測試劑盒說明操作。上機檢測后以Flow Jo軟件分析。

1.2.8ELISA測定小鼠血漿SOD、MDA及CAT的水平 各實驗組隨機取8只小鼠，末次給藥24 h后，眼眶取血，低溫高速離心取血漿。小鼠血漿中SOD、MDA及CAT的含量檢測以相應ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.9Western blot法檢測NF-κB p65、TLR2蛋白表達情況 取剪碎的脾臟組織于自動勻漿機中充分勻漿，加入600 μl組織蛋白裂解液冰上裂解 15 min，4℃下以14 000 r/min轉速離心 10 min，收集上層清液。BCA法測定相應蛋白濃度。取等量樣品以12% SDS-PAGE電泳分離，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉緩沖液室溫封閉2 h，經兔多抗NF-κB p65(1∶2 000)、兔多抗TLR2(1∶1 000)、內參β-actin(1∶1 000)等一抗4℃搖床孵育過夜，充分洗滌后，再以相應辣根過氧化酶標記的二抗37℃搖床孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯影。以美國 UVP 分析儀器掃描膠片，再以Quantity One 軟件分析各蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1小鼠免疫器官指數測定結果 如圖1，較對照組而言，模型組小鼠的胸腺指數和脾臟指數均顯著降低(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組小鼠的脾臟指數和胸腺指數上升，但差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組和高劑量組小鼠的脾臟指數和胸腺指數均顯著上升(P<0.05)，且高劑量組的脾臟指數和胸腺指數大于中劑量組。

2.2小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測結果 Giemsa染色結果顯示(圖2A)，巨噬細胞吞噬雞紅細胞程度不同：未被吞噬的雞紅細胞呈粉紅色，散在分布，也有部分聚集在巨噬細胞周圍，而吞噬細胞則呈球形，著藍色；已吞入雞紅細胞的巨噬細胞整體形狀不規(guī)則，著色加深；有的巨噬細胞吞入了多個紅細胞，體積變大且著色更深，為紫黑色。統計結果顯示(圖2B、C)，模型組吞噬百分率和吞噬指數均極顯著低于對照組(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數均上升，其中吞噬百分率差異無統計學意義(P>0.05)，而吞噬指數統計有差異性(P<0.05)；中劑量組及高劑量組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數均顯著上升(P<0.01)，且高劑量組的吞噬百分率和吞噬指數均大于中劑量組。

2.3小鼠血漿免疫球蛋白及細胞因子水平測定結果 根據圖3A、B，與對照組相比，模型組的IL-2、IL-4水平明顯下降(P<0.000 1)；與模型組相比，給予不同劑量槲皮苷干預組小鼠的IL-2、IL-4水平均發(fā)生明顯上升(P<0.05)，且高劑量組的IL-2、IL-4水平均高于中劑量組。同時，模型組IgG、IgM含量較之于對照組顯著下降(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷組的IgG含量均上升但差異未有統計學意義(P>0.05)，IgM的含量統計差異性顯著上升(P<0.000 1)；中劑量組和高劑量組的IgG、IgM含量均顯著上升(P<0.01)，且高劑量組的IgG、IgM含量均大于中劑量組(圖3C、D)。

圖1 小鼠免疫器官指數測定Fig.1 Determination of immune organ indices of miceNote: ###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，***.P<0.000 1 vs model group.Control.Control group；CTX Model.Model group which was dealt with cyclophosphamide (200 mg/ml)；CTX+QIL.Group which was dealt with both cyclophosphamide and low dose of quercitrin (20 mg/ml)；CTX+QIM.Group which was dealt with both cyclophosphamide and medium dose of quercitrin (50 mg/ml)；CTX+QIH.Group which was dealt with both cyclophosphamide and high dose of quercitrin (80 mg/ml),similarly hereinafter.

圖2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測

Fig.2 Detection of phagocytic function of mouse perito-neal macrophages

Note: A.Result of giemsa staining (×400)；B.Statistical graph of phagocytosis percentage；C.Statistical graph of phagocytosis index.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.000 1 vs model group.

圖3 ELISA檢測小鼠血漿IgG、IgM及IL-2、IL-4細胞因子含量Fig.3 Detection of plasma IgG,IgM,IL-2,IL-4 cytokines in mice by ELISANote: A.IL-2;B.IL-4;C.IgG;D.IgM.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.000 1 vs model group.

2.4小鼠免疫器官組織的影響 觀察并分析HE染色結果發(fā)現，對照組的小鼠脾臟結構清晰，脾小體較大，中央動脈周圍淋巴細胞較為密集；模型組小鼠脾臟組織白、紅髓分界不清晰，脾小結數量減少；給予槲皮苷干預的各組脾臟白、紅髓分界隨劑量增大逐漸變清晰，脾小體數量逐漸增多，體積較模型組大；淋巴細胞數量也隨著槲皮苷劑量的增加較模型組增多(圖4)。

圖4 小鼠免疫器官組織學觀察Fig.4 Histological observation of mouse immune organsNote: The dark blue round or oval body are white pulp;the purple parts are mainly red pulp.

2.5小鼠脾淋巴細胞亞群檢測結果 由圖5可知，模型組的CD4+、CD8+脾淋巴細胞水平和CD4+/CD8+值均顯著低于對照組(P<0.000 1)；與模型組相比，低劑量槲皮苷干預下小鼠CD4+脾淋巴細胞水平及CD4+/CD8+值均顯著高于模型組(P<0.05)，CD8+脾淋巴細胞水平較之模型組差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組和高劑量組的CD4+、CD8水平以及CD4+/CD8+值均顯著上升(P<0.000 1)。

2.6小鼠脾臟細胞ROS水平的影響 DCF的熒光強度代表了細胞內ROS水平的高低。根據流式結果，模型組脾臟細胞ROS水平顯著高于對照組(P<0.000 1)；給予不同劑量槲皮苷干預的各組均較模型組ROS水平升高，差異有顯著統計學意義(P<0.000 1)，見圖6。

2.7小鼠血漿中SOD、MDA及CAT水平的檢測 與對照組相比，模型組的SOD和CAT水平明顯降低(P<0.000 1)，而MDA水平則顯著升高(P<0.000 1)；相較于模型組，槲皮苷低劑量組的SOD和CAT水平升高但差異無統計學意義(P>0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.000 1)；槲皮苷中劑量組和高劑量組的SOD和CAT水平均顯著升高，且MDA水平顯著降低(P<0.01)。結果見圖7。

圖5 流式檢測小鼠脾CD4+、CD8+淋巴細胞亞群含量Fig.5 Flow cytometry detection of CD4+,CD8+ lympho-cyte subsets in mouse spleenNote: A.Result of flow cytometry;B.Statistical result of CD4+;C.Statistical result of CD8+;D.Statistical result of CD4+/CD8+.###.P<0.000 1 vs control group;*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

圖6 流式細胞術檢測小鼠脾臟細胞ROS水平Fig.6 Flow cytometry detection of ROS levels in mouse spleen cellsNote: A.Flow cytometry.B.Respective statistical result.###.P<0.000 1 vs control group;***.P<0.000 1 vs model group.

圖7 小鼠血漿中SOD、MDA及CAT水平檢測結果Fig.7 Results of SOD,MDA and CAT levels in mouseplasmaNote: A-C.Statistical results of SOD,MDA and CAT level,respectively.###.P<0.000 1 vs control group;**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

圖8 WB檢測脾臟NF-κB p65、TLR2蛋白表達水平變化Fig.8 WB determination of NF-κB p65 and TLR2 prote-in expression levels in spleenNote: A.Band of NF-κB p65 and TLR2 protein,respectively;B and C.Statistical graphs showing NF-κB p65 and TLR2 protein levels,respectively.###.P<0.000 1 vs control group；*.P<0.05，**.P<0.01,***.P<0.000 1 vs model group.

2.8WB檢測結果 如圖8，模型組中WB所檢測NF-κB p65及 TLR2蛋白的表達水平較之對照組均顯著升高(P<0.000 1)；槲皮苷各劑量組的NF-κB p65及 TLR2蛋白水平均發(fā)生顯著下降(P<0.000 1)，且隨著劑量增加，NF-κB p65及 TLR2蛋白水平下降越明顯。

3 討論

免疫力低下是導致疾病發(fā)生的關鍵原因之一。脾臟是機體最大的免疫器官，是機體的細胞免疫和體液免疫中心，既可通過吞噬作用發(fā)揮非特異性免疫功能，又可通過T、B細胞介導的細胞免疫和體液免疫發(fā)揮特異性免疫功能[6]。而胸腺作為機體免疫體系的主要內分泌腺體，可通過分泌T細胞及胸腺素來參與機體細胞免疫過程，使機體保持免疫穩(wěn)態(tài)。胸腺可調控T細胞的分化成熟，使其表達不同的抗原，根據產生的免疫表型的不同分為CD4+、CD8+亞群，CD4+、CD8+T細胞可雙向調控免疫應答，二者的比例失調會導致免疫功能失常。CD4+T細胞又可在外源抗原的刺激誘導下分化為Th1和Th2兩類細胞，Th1細胞可分泌IFN-γ和IL-2，介導細胞應答；而Th2則主要產生IL-4、IL-6等細胞因子來介導體液免疫應答，其含量及功能變化決定機體免疫功能[7-9]。另外，IgG、IgM水平也是反映體液免疫能力的常用指標之一[10]。本研究通過CTX引起小鼠胸腺及脾免疫器官指數、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平顯著下降，表明小鼠免疫抑制模型成功。分別給予50 mg/ml和 80 mg/ml槲皮苷干預均可顯著上調免疫抑制小鼠的免疫器官指數、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平，20 mg/ml槲皮苷干預下免疫抑制小鼠的免疫器官指數、腹腔巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數、CD4+、CD8+亞群及CD4+/CD8+值、IgG、IgM、IL-2及IL-4水平等指標也均得到上調，但部分指標差異無統計學意義；脾臟組織病理學觀察結果也顯示脾臟紅、白髓的分界隨著槲皮苷干預劑量的增加逐漸清晰，高倍鏡下觀察到淋巴細胞也逐漸增多；以上均表明槲皮苷可呈劑量依賴性促進損傷脾臟組織的修復，并有助于淋巴細胞的增殖，調節(jié)淋巴細胞分泌細胞因子水平，促進吞噬功能恢復，增強免疫抑制小鼠的免疫器官功能，最終增強免疫低下小鼠的免疫功能。綜上所述，槲皮苷可從器官、細胞及分子層面上上調機體的細胞免疫與體液免疫水平，其作用具有劑量依賴性。

研究表明，氧化應激可引起DNA損傷、蛋白變性或脂質過氧化，表現為線粒體等損傷，最終使細胞被氧化損傷無法恢復，誘發(fā)機體患病[11]。王斌等[12]研究表明，高脂膳食誘導大鼠處于氧化應激狀態(tài)時，大鼠的體液免疫應答水平明顯下降，且Billertakahashi等[13]也證實ROS含量過高可能導致機體免疫功能受抑，表明免疫功能的強弱與機體的抗氧化水平有關。因此，本實驗進一步探究槲皮苷對免疫抑制小鼠抗氧化水平的影響。結果槲皮苷可以劑量依賴方式下調模型組ROS、MDA水平同時上調SOD、CAT水平，提高機體抗氧化水平；這與Jiang等[14]研究發(fā)現槲皮苷具有直接清除活性氧能力的結果相吻合。

NF-κB是核轉錄因子，家族成員包括p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、RelA(p65)、RelB和cRel，參與調控氧化應激過程。正常細胞中NF-κB p50/p65二聚體與它的抑制蛋白(IκB)結合而處于三聚體狀態(tài)，存在于胞漿。受外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化、泛素化并被降解，三聚體因此解離，NF-κB p50/p65轉入細胞核并與DNA的靶向序列相結合，從而啟動轉錄，在免疫、炎癥、氧化及細胞凋亡等方面起重要作用[15，16]。NF-κB是TLR2信號通路的下游靶標蛋白，有研究證實來自生殖支原體的三?；鞍卓梢酝ㄟ^TLR1和TLR2激活NF-κB的表達[17]。本研究中槲皮苷以劑量依賴方式顯著下調小鼠脾臟組織NF-κB p65和TLR2蛋白的表達水平(P<0.05)，表明槲皮苷可能通過抑制NF-κB p65和TLR2蛋白的表達來改善小鼠免疫功能低下狀態(tài)。具體作用機制可能是通過抑制NF-κB p65和TRL2蛋白的表達，降低ROS水平并提高SOD水平和機體抗氧化水平，從而促進免疫器官功能恢復來提高免疫功能低下小鼠的免疫水平。

綜上，槲皮苷能促進免疫低下機體恢復免疫功能，并呈劑量依賴性。其可能的機制是抑制NF-κB p65和TRL2等蛋白表達，調節(jié)機體免疫相關細胞因子及抗氧化物質，提高機體抗氧化水平，增強免疫器官水平，最終起到增強免疫低下小鼠免疫力的作用。