垂體瘤患者外周血T細胞和NK細胞LAG3 表達的研究①

吳其艷 吳亮亮 彭耀軍 賈興旺 劉天懿 顏光濤

(解放軍醫學院,北京 100853)

垂體瘤是腺垂體細胞引發的單克隆腫瘤，約占所有腦腫瘤的15%～20%，僅次于腦膜瘤及腦膠質瘤[1,2]。雖然被認為是良性腫瘤，但多達25%～55%的垂體瘤顯示出與惡性腫瘤相似的特征，如向周圍組織侵襲生長、生長速度較快且尺寸較大，具有較高的復發率，對常規治療(包括放射治療)抵抗等，給患者生命健康造成極大威脅[3,4]。近期研究認為，垂體瘤的侵襲行為和復發與免疫系統關系密切[5]。T細胞和NK細胞是參與抗腫瘤免疫應答的主要免疫細胞，其抗腫瘤免疫應答的產生需要多種信號通路的參與，包括正性調節和負性調節通路。淋巴細胞活化基因3 (Lymphocyte-activation gene 3, LAG3)是近年來發現的重要的免疫抑制受體之一,主要表達于活化的T 細胞和 NK 細胞表面，具有多種生物學功能[6,7]。越來越多的研究表明，有效抗腫瘤應答的匱乏可能與LAG3的負性調控作用相關[8]。目前,尚未見有關垂體瘤患者外周血免疫細胞 LAG3 表達的報道。本研究應用流式細胞術檢測垂體瘤患者和健康志愿者外周血T細胞和 NK 細胞表面 LAG3的表達變化，初步探討垂體瘤的免疫抑制機制，為垂體瘤的診治尋找有效的生物標志物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料 選取2017年至2018年解放軍總醫院神經外科接受治療的30例垂體瘤患者，其中男15例，女15例，年齡52(25～72)歲。所有患者均經術后病理確診為垂體瘤，采血前均未接受手術、放療及化療等抗腫瘤治療，且排除自身免疫性疾病、急慢性感染及其他惡性腫瘤等。其中促性腺激素型垂體腺瘤14 例，混合型垂體腺瘤6 例，催乳素型垂體腺瘤4例，生長激素型垂體腺瘤2 例，促腎上腺皮質激素型垂體腺瘤2 例，無功能型垂體腺瘤2 例。選擇同期30例健康人為健康對照組，其中男15例，女15例，年齡50(22～65)歲，兩組間性別、年齡差異無統計學意義。

1.1.2試劑 鼠抗人CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PE-CY5、CD8-FITC、CD56-APC熒光素標記單克隆抗體購于美國Beckman Coulter公司；鼠抗人LAG3-PE、IgG1-PE(同型對照)熒光素標記單克隆抗體購于美國BD公司；人外周血單核細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；采用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀進行檢測。

1.2方法 收集垂體瘤患者及健康對照組靜脈血，用EDTA抗凝，采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。PBMC樣本采用500 μl PBS 重懸，每個流式管加入50 μl 細胞懸液，每個樣本檢測均設置單陽對照和同型對照，依次加入以下抗體各5 μl：①CD45-KO；②CD3-PC7；③CD4-PC5；④CD8-FITC；⑤CD56-APC；⑥IgG1 K-PE；⑦LAG3-PE；⑧CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、IgG1 K-PE；⑨ CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、LAG3-PE；室溫避光孵育20 min，加1 ml PBS混勻終止反應，2 000 r/min 離心3 min，重復洗2次后棄上清液，加入500 μl PBS 重懸細胞，流式細胞儀檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞和CD3-CD56+NK 細胞的比例，及各細胞亞群LAG3分子的表達，采用Flowjo軟件進行結果分析。

2 結果

2.1垂體瘤患者T細胞和NK細胞比例的變化 流式細胞術選取外周血中CD45+的白細胞，檢測其中CD4+T、CD8+T和 NK 細胞的比例(圖1)。結果顯示，垂體瘤組 CD4+T 細胞比例較健康對照組顯著增高[(48.020±4.554)% vs (44.090±5.957)%，P=0.005 7]，如圖2A所示。垂體瘤組與健康對照組CD8+T細胞比例分別為 (22.720±6.835)%和(21.55±4.63)%，兩者無統計學差異(P=0.442 5)，如圖2B所示。垂體瘤組與健康對照組NK 細胞比例分別為 (7.937±3.137)% 和 (11.930±2.767)%，垂體瘤組 NK 細胞比例較健康對照者顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖2C。

2.2垂體瘤患者外周血T細胞和NK細胞LAG3的表達 分別選取外周血CD4+T、CD8+T和NK細胞，檢測其表面抑制性受體LAG3的表達(圖1)。結果顯示，與健康對照組相比，垂體瘤患者外周血CD4+T細胞表面LAG3的表達顯著增高[(18.450±6.462)% 和 (11.610±9.364)%，P<0.01] (圖3A)；同樣，垂體瘤患者外周血CD8+T 細胞表面LAG3的表達顯著增高[(37.85±13.04)%和(18.04±11.76)%，P<0.001](圖3B)； 與此同時，垂體瘤患者外周血NK 細胞表面 LAG3的表達顯著增高[(32.94±13.8)% 和 (19.34±10.64)%，P<0.001](圖3C)。

圖1 流式細胞術檢測人外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞和 NK 細胞表面LAG3表達的流程圖Fig.1 Expression of LAG3 on CD4+T cells,CD8+T cells and NK cells

圖2 垂體瘤患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞和 NK 細胞的比例Fig.2 Frequency of CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results；Right panel.Summary graphs represent the frequency of indicated cells between the two groups.

圖3 垂體瘤患者外周血CD4+T、CD8+T和NK細胞表面LAG3的表達Fig.3 Expression of LAG3 on CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results;Right panel.Summary graph represents the frequency of indicated cells between the two groups.

3 討論

垂體具有特殊的免疫特性，在解剖學上與大腦相連，卻不受血腦屏障的保護，因此能夠接受血源性免疫細胞的攻擊[9]。有研究指出，垂體瘤免疫微環境中具有不同程度炎癥免疫細胞浸潤[10,11]。輔助性 T 細胞，包括 Th1/Th2 和 Th17細胞，通過產生多種細胞因子，參與垂體瘤的炎癥應答；與此同時，免疫細胞產生的不同細胞因子，能誘導和募集不同的免疫細胞亞群，共同參與垂體瘤的進展[12]。本研究表明，垂體瘤患者外周血 CD4+T 細胞比例增高，然而具體機制尚不清楚，鑒于CD4+T細胞亞群的異質性，仍需要進一步明確各亞群細胞比例變化對垂體瘤患者免疫功能的影響。與大多數報道一致，研究中并未觀察到與健康組CD8+T細胞比例存在差異，可能仍需要擴大樣本量或者進一步細化細胞亞群后進行研究。此外，垂體瘤患者NK細胞比例與健康組相比顯著降低，較低數量的NK細胞可能影響機體的免疫防御功能，使其無法發揮有效的抗腫瘤免疫應答[13]。

LAG3作為天然免疫和適應性免疫的一種重要調節子，在腫瘤的免疫耐受中發揮著不容忽視的作用。LAG3的分子結構與CD4相似，能夠以更強的親和力與MHCⅡ結合，抑制特異性CD4+T細胞增殖和細胞因子分泌，從而限制CD4+T細胞的抗腫瘤免疫應答。多種腫瘤，如卵巢癌、腎癌、黑色素瘤和淋巴瘤等通過高表達LAG3介導CD8+T 細胞的功能耗竭[14,15]。此外，LAG3在調節性T細胞表面組成性表達，促進其發揮免疫抑制功能[16]。Kotaskova等[17]發現，在慢性淋巴細胞白血病中，高表達 LAG3 預示了較差的預后。大量證據表明，LAG3 的功能與 PD-1 類似，能夠抑制T細胞的過度活化和增殖，從而促進腫瘤逃逸，而封閉LAG3 后，T 細胞耗竭狀態可被逆轉[18-21]。目前，已開展多項臨床研究，評估阻斷LAG3與其經典配體MHCⅡ結合所達到的抗腫瘤作用[6,22]。值得注意的是，LAG3能夠抑制CD8+T細胞和NK細胞的功能，并不依賴于和MHCⅡ結合，提示可能有其他的機制共同參與LAG3介導的免疫抑制；研究其選擇性結合的配體及免疫學作用，或將為免疫治療提供新的思路[23]。我們進一步分析了外周血 CD4+T、CD8+T 和 NK 細胞表面 LAG3 的表達，發現垂體瘤患者外周血3種免疫細胞表面 LAG3 表達的陽性率均顯著高于健康對照者，提示 LAG3 可能參與介導了垂體瘤患者的免疫耐受，在垂體瘤的進展中發揮了重要作用。下一步將繼續深入研究 LAG3 對垂體瘤患者免疫功能的影響和其作為腫瘤標志物的可能性。

綜上所述，本研究發現垂體瘤患者外周血 CD4+T 細胞比例增高，NK 細胞的比例顯著降低，而 T 細胞和 NK 細胞表面 LAG3 的表達顯著增高，進一步探究 LAG3 在垂體瘤中的生物學功能及其分子機制，或將為垂體瘤的診治提供新的靶點。