胃癌組織COX-2、VEGF、FGF2的表達及其與微衛星不穩定性關系的研究*

應曉媚,劉秀靜

(1.浙江省溫州市中醫院病理科 325000；2.溫州醫科大學附屬第二醫院檢驗科，浙江溫州 325000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，位于我國惡性腫瘤發病率的首位，其主要發病年齡為50歲及以上，男女比例為2∶1，具有明顯的地域差別[1-3]。由于早期胃癌診斷缺乏有效的特異性臨床生物學指標，且大部分早期胃癌患者無明顯臨床癥狀，所以臨床上發現胃癌多已屬中、晚期。有研究表明，胃癌的發生通常受到遺傳、環境等多種因素影響。隨著現代醫療水平的不斷提高，逐漸有研究發現胃癌組織通常會伴隨環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達升高，且多數學者研究證實COX-2選擇性抑制劑具有良好的抗腫瘤治療效果[4-7]。腫瘤的發生基礎為新生血管是目前臨床醫師廣泛接受的理論，人體腫瘤細胞通過刺激炎性細胞后釋放血管新生相關因子，故血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種具有高度特異性的促進血管內皮細胞生長的因子[8-10]。大量臨床研究表明，部分腫瘤患者血清成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)水平明顯高于身體健康者，因此腫瘤患者的血清FGF2水平可作為臨床專科醫師進行腫瘤診斷及預后評估的潛在可靠指標[11-14]。微衛星不穩定性是一種遺傳性改變，現通常將微衛星不穩定性陽性的胃癌劃分為高微衛星不穩定性與低微衛星不穩定性[11，15-16]。既往對于胃癌COX-2、VEGF、FGF2的表達水平及胃癌中微衛星不穩定研究較多，但研究COX-2、VEGF、FGF2與微衛星不穩定性關系的相關性研究較少，故本研究選取確診為胃癌的67例患者的臨床資料進行回顧性研究，分析胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達及其與微衛星不穩定性的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取溫州市中醫院2014年1月至2018年6月確診為胃癌的67例患者作為研究對象，其中男44例，女23例，年齡38～75歲，平均(58.12±3.59)歲，胃腸外科手術切除的胃癌及相應癌旁正常組織標本各67例用于研究胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達及其與微衛星不穩定性的關系，標本切除后立即凍存，每個標本一部分用于DNA抽提，剩余部分由10%甲醛將其固定后石蠟包埋，切片由蘇木素-伊紅染色，所有標本均由兩位經驗豐富的病理科醫師做出病理診斷，排除具有腫瘤家族史及既往接受過放療和化療的患者。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色法檢測COX-2、VEGF、FGF2表達 石蠟包埋標本層厚4 μm進行連續切片后常規脫蠟，切片放置于檸檬酸緩沖液中進行微波加熱修復抗原，其一抗為濃度為1∶200的山羊抗人COX-2多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人VEGF多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人FGF2多克隆抗體，過夜孵育后進行生物素化二抗，其細胞核用蘇木素復染中性樹脂進行封片；以細胞質或細胞核內出現棕黃色顆粒或棕黃色團塊為陽性細胞，COX-2高表達信號位于細胞質中，以主要顯色部位為判斷標準，低表達為COX-2、VEGF、FGF2基本不著色、著色細胞低于5%或著色細胞占整張切片5%～25%，高表達為著色細胞范圍占整張切片超過25%。

1.2.2PCR檢測微衛星不穩定性 應用DNA提取試劑盒提取癌組織及癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度法定量。DNA抽提具體步驟按照試劑盒說明書進行，研究對象的腫瘤組織基因組與正常組織基因組DNA經電泳后確定提取成功，選取5個微衛星位點：BAT-26、BAT-40、D2S123、D17S250、D5S346,采用同一條件進行擴增，反應體系為20 μL，其模板為200 ng，引物各15 pmol，其中dNTPs 0.5 μL,RedTaq DNA聚合酶 1.5 μL。預變性94 ℃ 2.5 min,循環參數為94 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s,35個循環,72 ℃延伸10 min。產物行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后凝膠成像照相保存，將同一患者的腫瘤組織與正常組織標本所顯示的條帶進行比較。判定標準：腫瘤組織出現DNA條帶而正常組織未出現條帶則判斷為微衛星不穩定性陽性，陽性標本重復1次，患者出現2個或2個以上微衛星位點為高微衛星不穩定性，出現1個微衛星位點為低微衛星不穩定性，無微衛星位點出現為微衛星穩定性，微衛星位點越多，則說明腫瘤發生途徑與微衛星不穩定性越相關。其特異性引物合成序列見表1。

表1 微衛星引物序列

1.3統計學處理 采用SPSSP22.0軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1COX-2表達與微衛星不穩定性的關系 67例胃癌標本中，微衛星穩定性38例(56.72%)，微衛星不穩定性29例(43.28%)，高微衛星不穩定性COX-2低表達率明顯高于COX-2高表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。高微衛星不穩定性COX-2低表達率明顯高于微衛星穩定性COX-2低表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。比較高、低微衛星不穩定性及微衛星穩定性COX-2表達率的構成，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 COX-2表達與微衛星不穩定性的關系

a：P<0.05，與同狀態COX-2高表達比較；b：P<0.05，與微衛星穩定性COX-2低表達比較

2.2VEGF表達與微衛星不穩定性的關系 67例胃癌標本中，高微衛星不穩定性VEGF高表達率明顯低于微衛星穩定性及低微衛星不穩定性，差異有統計學意義(P<0.05)。高微衛星不穩定性VEGF高表達率明顯低于同狀態VEGF低表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。比較高微衛星不穩定性、低微衛星不穩定性及微衛星穩定性VEGF表達率的構成，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 VEGF表達與微衛星不穩定性的關系

a：P<0.05，與高微衛星不穩定性VEGF高表達比較；b：P<0.05，與同狀態VEGF高表達比較

2.3FGF2表達與微衛星不穩定性的關系 67例胃癌標本中，高微衛星不穩定性FGF2高表達率明顯高于微衛星穩定性及低微衛星不穩定性，差異有統計學意義(P<0.05)。高微衛星不穩定性FGF2高表達率明顯高于同狀態FGF2低表達率，差異有統計學意義(P<0.05)。比較高微衛星不穩定性、低微衛星不穩定性及微衛星穩定性FGF2表達率的構成，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

2.4微衛星不穩定狀態PCR檢測結果 BAT-26、BAT-40、D2S123、D5S346、D17S250的微衛星不穩定狀態電泳圖，見圖1。

表4 FGF2表達與微衛星不穩定性的關系

a：P<0.05，與同狀態FGF2高表達比較;b:P<0.05，與高微衛星不穩定性FGF2高表達比較

N：癌旁正常組織；T：胃癌組織

圖1 5個位點的微衛星不穩定狀態PCR結果

3 討論

微衛星是基因組中的核苷酸簡單重復序列，通常為堿基重復，可用于遺傳標記、遺傳連鎖圖的構建及基因的定位，其微衛星不穩定性則是因復制錯誤引起的簡單重復序列的變化，進而引起腫瘤的發生與轉移[17-19]。在目前的醫療研究水平下，學界認為人類大多數疾病發生的主要原因是人體遺傳物質的突變。

胃癌微衛星不穩定性在既往研究中的檢出率可達34%，說明微衛星不穩定性能夠作為胃癌發展過程中的診斷指標之一。本研究中高微衛星不穩定性COX-2低表達率明顯高于COX-2高表達率，高微衛星不穩定性COX-2低表達率明顯高于微衛星穩定性COX-2低表達率。COX-2是在患者體內細胞受到刺激時迅速合成的限速酶，主要調控細胞增殖與抑制細胞凋亡、促進患者體內血管生成及腫瘤轉移。有研究表明，COX-2在胃癌、乳腺癌及卵巢癌等腫瘤組織中表達水平明顯降低，本研究結果表明微衛星不穩定性途徑發生的腫瘤通常會伴隨COX-2的低表達，與既往研究結果一致。

VEGF作為一種能夠增強微血管滲透性浸潤的強效內皮細胞有絲分裂元，與腫瘤的發展、轉移具有密切關系。VEGF作為腫瘤血管新生最主要的刺激因子之一，能夠解釋本研究中微衛星不穩定性胃癌存在的侵襲性及轉移性，也有部分原因可能是依賴于腫瘤活躍的微血管滲透性。本研究中胃癌VEGF高表達，占55.22%(37/67)，67例腫瘤標本中，高微衛星不穩定性VEGF高表達率明顯低于微衛星穩定性及低微衛星不穩定性，高微衛星不穩定性VEGF高表達率明顯低于同狀態VEGF低表達率，本研究在一定程度上能夠說明不同新生血管形成的途徑會造成患者VEGF的表達不同，預后較好可能與VEGF低表達相關。

FGF2存在于人體多個器官組織和細胞中，FGF2在惡性腫瘤組織中的表達會明顯升高，與本研究基本一致。本研究胃癌FGF2高表達45例，占67.16%；67例腫瘤標本中，高微衛星不穩定性FGF2高表達率明顯高于微衛星穩定性及低微衛星不穩定性，高微衛星不穩定性FGF2高表達率明顯高于同狀態FGF2低表達率，FGF2與細胞膜上相應受體結合后會導致患者體內腫瘤細胞分裂與增殖，促進腫瘤組織新生血管的形成，導致患者腫瘤的發生與發展。且既往研究表明，乳腺癌、肺癌患者血清FGF2表達會明顯高于健康人，進而證實了血清FGF2與腫瘤的相關性。

綜上所述，胃癌發生過程中可能存在微衛星不穩定性狀態，且可能伴隨COX-2表達降低，微衛星不穩定性胃癌存在不同的新生血管形成的途徑，其VEGF表達較低，FGF2表達偏高。