高錳脅迫對香根草礦質元素吸收及光合系統的影響

申須仁，董名揚，王朝勇，王 杰，周 強，3*

（1.吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000；2.錳鋅釩產業技術協同創新中心，湖南 吉首416000；3.錳鋅礦業重金屬污染綜合防治技術湖南省工程實驗室，湖南 吉首 416000）

錳（Mn）是植物代謝過程中必需的微量元素，當Mn含量超標時，植物會發生Mn毒反應，對植物的產量、生長發育、光合作用、礦質營養吸收等生理代謝活動均產生負面的影響[1-2]。Mn毒害也被認為是限制植物在酸性及漬水土壤生長的重要因素[3]。在我國南方地區的酸性土壤中、pH較低的水稻土壤中以及Mn礦區及尾渣庫區的土壤中，Mn離子大量積累，對農作物生長及農產品環境安全造成巨大的危害[4]。尤其是在礦區，Mn元素可以通過各種途徑進入農田土壤中[5]，灌溉農田土壤中Mn含量可達5700 mg·kg-1，其最大值可達10 000 mg·kg-1。礦渣堆周邊的農田土壤Mn含量也接近1000 mg·kg-1，蔬菜中的Mn含量超過正常值5～80倍，亟待治理[6-7]。

近年來，重金屬植物修復技術日益受到社會的重視和關注[8]。香根草[Vetiveria zizanioides（L.）Nash]是禾本科香根草屬多年生C4類草本植物，根系發達、生物量大，每年干草產量可達100 t·hm-2。能夠適應旱澇、酸堿等多種環境，并對多種重金屬都有較強的耐受和積累能力，已廣泛應用于環境修復領域[9-10]。其在農田生態系統中也有較廣泛的應用。通過與作物間作，香根草可以防止農田水土流失、誘集作物害蟲、修復多環芳烴污染土壤等[11-12]。所以，香根草在農業及廢棄地的生態修復領域有著良好的應用前景。但目前對于采用植物修復技術治理高Mn污染的基礎和應用研究較少，香根草對高Mn脅迫耐受和生理響應也未見報道。所以，本文采用實驗室水培試驗，研究高Mn脅迫對香根草礦質元素吸收和光合系統的影響，揭示香根草對高Mn脅迫的耐受范圍、Mn積累特征及生理響應，以期為香根草用于高Mn污染地區環境修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用香根草由試驗室長年種植在未受污染的苗圃中，在試驗準備階段，將分蘗繁殖得到的香根草幼苗單株培養，挑選長勢健壯的香根草（苗齡5個月）置于1/2Hoagland營養液中培養，待其恢復生長后進行Mn脅迫處理。

1.2 試驗設計

每3株香根草固定于1個500 mL塑料盆中，以1/2Hoagland營養液作為培養液，Mn以MnSO4·H2O的形式直接加入營養液中。以1/2Hoagland營養液作為對照處理，其他處理組的Mn濃度分別為：15、30、60、120 mmol·L-1，營養液pH調節至5.8，并隔日更換。于植物培養箱中生長60 d。培養條件為晝夜溫度分別為（28±2）℃和（22±2）℃；白晝16 h·d-1；光照強度1000 μmol·m-2·s-1。每處理設置3個重復（即每處理3盆9株苗）。

1.3 含水率、株高、SPAD值、植株干物質質量的測定

將植物用去離子水多次沖洗，吸干表面水分稱鮮質量。分離根、葉組織，在105℃下殺青20 min，70℃下烘48 h至恒質量，冷卻至室溫后稱干質量（即整個植株干物質質量）。植物含水率=（鮮質量-干質量）/鮮質量×100%。植物株高用卷尺測量基部到葉片最高點的高度。采用SPAD-502葉綠素儀（Konica Minolta Sensing，日本）夾取植物倒3或倒4葉的1/4處和3/4處測量植物SPAD值。

1.4 Mn及礦質元素含量的測定

將香根草干樣粉碎過60目篩。稱取0.1 g并加入HNO3和HClO4（V∶V=4∶1）靜置6～8 h，然后于石墨消解儀消煮至溶液澄清，冷卻并定容于25 mL，再經濾紙過濾，于安捷倫240fs火焰原子吸收光譜儀（安捷倫，美國）測定礦質元素含量[13]；以24種金屬元素混合標準液（GSB04-1767-2004）配制5個梯度濃度的標準液，制作標準曲線。每測定5～10個樣品，將儀器重新置零，并測量一個濃度的標準品，以監測儀器的穩定性。

1.5 Mn富集系數與轉移系數的測定[14]

Mn的根系富集系數=Croot/Csolution

Mn的轉移系數=Cleaf/Croot×100%

富集量=Wroot×Croot+Wleaf×Croot

式中：Csolution表示培養液中的Mn含量；Croot表示根中的Mn含量；Cleaf表示葉中的Mn含量；Wroot表示根的干物質量；Wleaf表示葉的干物質量。

1.6 光合作用參數的測定

采用Li-6400便攜式光合儀（LICOR，美國）于9：30—11：00進行測定，植物先在陽光下進行充分光誘導，然后進行光合測量。葉室光強根據環境光強設置為 1300 μmol·m-2·s-1，凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cond）、胞間二氧化碳濃度（Ci）、蒸騰速率（Trmmol）均從儀器直接讀取。

圖1不同濃度Mn對香根草SPAD值（A）、葉片含水率（B）、株高（C）和植株干物質質量（D）的影響Figure 1 Effects of different concentrations of manganese on SPAD（A），leaf water content（B），plant height（C）and plant dry weight（D）of vetiver grass

1.7 葉綠素熒光參數的測定

采用PAM-2500（Walz，德國）于20：00以后進行測定，植物先放置在黑暗環境下進行30 min暗適應。梯度作用光強為 8、16、32、90、165、245、325、430、580、770、1100、1400、1700 μmol·m-2·s-1，測定間隔為30 s。PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、潛在最大電子傳導率（ETRmax）直接從儀器上讀取，PSⅡ實際光化學效率[Y（Ⅱ）]、調節性主動耗散[Y（NPQ）]、非調節性被動能量耗散[Y（NO）]均通過系統自動擬合得出。

1.8 數據分析

以上試驗數據使用SPSS 20.0進行Tukey算法以及多重比較分析，顯著性水平為P＜0.05，數據均以平均值±標準誤表示。并采用該軟件中Pearson相關系數和雙側顯著性檢驗進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 Mn對香根草SPAD、含水率、株高、植株干物質質量的影響

與對照相比，15、30 mmol·L-1Mn處理中，SPAD略微下降，但未達到顯著差異水平；當Mn處理濃度在60 mmol·L-1和120 mmol·L-1時其出現顯著性下降，且在120 mmol·L-1時，SPDA值最低，僅為對照的35.5%（圖1A）。而香根草的含水率、株高、植株干物質質量在Mn處理濃度≥30 mmol·L-1時即出現明顯的降低，株高、植株干物質質量下降已達到顯著差異水平。隨著Mn處理濃度的增加，3個參數下降的幅度更大。在120 mmol·L-1時，其分別為對照組的51.5%、70.3%和50.5%（圖1B、圖1C、圖1D）。

2.2 Mn對香根草Mn含量、富集系數和轉移系數的影響

Mn處理的根、葉中Mn含量均顯著高于對照。在根部，30～120 mmol·L-1處理組間的Mn含量沒有明顯差異，且顯著高于15 mmol·L-1Mn處理組（圖2A）。而在葉中，15～60 mmol·L-1處理組間的Mn含量沒有明顯差異，但在120 mmol·L-1Mn處理時出現大幅度上升（圖2B）。其轉移系數的變化與葉片中的Mn含量變化一致。在15～60 mmol·L-1Mn處理下，轉移系數為24.5%～28.1%，在120 mmol·L-1時，轉移系數增加至66.5%（圖2C）。香根草根系對Mn的富集系數隨著Mn處理濃度的增加而顯著降低，在120 mmol·L-1時降至2.9；Mn處理下根系的Mn富集系數始終大于1（圖2D）。而富集量則在99.9～135.1 mg·株-1間波動。其中，120 mmol·L-1處理下的富集量要顯著高于30、60 mmol·L-1處理（圖2E）。

圖2 不同濃度Mn對香根草根葉中錳含量、富集系數和轉移系數的影響Figure 2 Effects of different concentrations of manganese on manganese content in roots and leaves，and transfer coefficients enrichment coefficients and bioaccumulation quantity

2.3 Mn對香根草K、Mg、Fe吸收的影響

Mn處理的根、葉中K含量呈現下降的趨勢，當處理濃度≥30 mmol·L-1時，達到顯著性差異，其中，根中K含量的下降幅度遠大于葉中（圖3A）。根中的Mg含量在Mn處理下顯著下降，僅為對照的25.5%～39.4%，且Mn處理組之間的變化較?。▓D3B）。根的Fe含量則與Mg的變化相反，在Mn處理下呈現出不同程度的增幅，比對照組增加了1.9～3.9倍（圖3C）。與對照相比，葉中Mg和Fe的含量在各處理組有上升和下降不同的變化，但變化幅度總體不大（圖3B、圖3C）。

圖3 不同濃度Mn對香根草K、Mg、Fe吸收的影響Figure 3 Effect of different concentrations of manganese on the absorption of K，Mg and Fe in vetiver grass

2.4 Mn對香根草光合作用的影響

與對照組相比，Mn處理下Pn顯著降低了37.3%～81.0%，并隨著Mn濃度的增加而總體呈下降趨勢。尤其在120 mmol·L-1處理組，其Pn值僅為對照的19.0%（圖4A）。與Pn變化趨勢相反，Ci在Mn處理下顯著高于對照，且Mn處理組間的Ci較為相似（圖4C）。Trmmol和Cond的變化趨勢一致，在15 mmol·L-1處理組中，其與對照組無明顯變化，在30、60 mmol·L-1處理下則出現一定程度的增加，但在120 mmol·L-1處理下則出現大幅度的下降，并顯著低于對照水平（圖4B、圖4D）。

2.5 Mn對香根草葉綠素熒光參數的影響

Mn處理下香根草的Fv/Fm和ETRmax均呈現下降的趨勢。ETRmax在15 mmol·L-1處理下即出現顯著的下降，在60～120 mmol·L-1下降的幅度更大（圖5B）。而Fv/Fm在15～30 mmol·L-1處理下保持穩定，當Mn濃度上升至60、120 mmol·L-1時，其顯著低于對照組（圖5A）。隨著光強的增加，Y（Ⅱ）呈現下降的趨勢，而Y（NPQ）呈現上升的趨勢，Y（NO）基本保持穩定。Mn處理組的Y（Ⅱ）均低于對照，而Y（NO）均高于對照（圖5C、圖5E）；15、30 mmol·L-1Mn脅迫下，Y（NPQ）接近或低于對照；而30～120 mmol·L-1Mn脅迫下，Y（NPQ）總體高于對照（圖5D）。

3 討論

3.1 香根草對Mn脅迫的Mn耐受和積累能力及特點

過量的Mn會對植物產生一系列的生理毒害作用，多數植物對Mn的耐受濃度通常低于15 mmol·L-1。僅有水蓼[15]、木荷[16]等Mn超富集植物能夠耐受高濃度的Mn脅迫。考慮到礦區土壤中可能存在高濃度的Mn離子，所以，本研究中設置的Mn處理濃度達到了120 mmol·L-1，與金政等[16]在木荷研究使用Mn濃度接近。PSⅡ的最大量子產量（Fv/Fm）是衡量原初光能捕獲的最大能力的指標，植物處于逆境下，Fv/Fm下降，其直接反映植物受到外界脅迫程度[17]。植物葉綠素含量降低也是高Mn導致的脅迫傷害癥狀之一[18]。諸多研究表明在Mn脅迫下植物的Fv/Fm和葉綠素含量會明顯下降[19-20]。本研究發現，香根草Fv/Fm（圖5A）和SPAD（圖1A）在15～60 mmol·L-1內接近正常水平，植株干物質量（圖1D）也能維持在對照的77.6%～88.1%。說明香根草能夠耐受60 mmol·L-1以下的Mn環境，具有良好的Mn耐受能力。在60 mmol·L-1以下的Mn處理中，根和葉中的Mn含量分別為14 393～18 845 mg·kg-1和4118～4782 mg·kg-1；并且，根中的Mn富集系數也大于1?？傮w而言，香根草有良好的Mn積累能力，遠超于大多數植物（20～500 mg·kg-1）[19]。而且，在15～60 mmol·L-1的Mn環境下，根中的Mn含量已經達到Mn超積累植物的標準（Mn含量大于10 000 mg·kg-1）[19]，葉中的Mn含量達到該標準的40%。此外，試驗中香根草Mn的富集量在15～60 mmol·L-1的Mn環境中差異不顯著，可達99.9～115.2 mg·株-1。由于試驗用苗是苗期，其生物量并不大（對照組生物量僅23.4 g·株-1），導致富集量偏小，有研究報道在4株·m-2密度下，經過8個月的生長，香根草的每株生物量可達300 g[21]，據此推測，香根草在高Mn環境中富集量相當可觀，顯示其具有用于高Mn污染環境修復的潛力。

圖4 不同濃度Mn對香根草凈光合速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率的影響Figure 4 Effect of different concentrations of manganese on net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Cond），intercellular carbon dioxide concentration（Ci）and transpiration rate（Trmmol）of vetiver grass

在Mn處理下，香根草根部Mn的含量高于葉片，Mn轉移系數為24.5%～28.1%（圖2A、圖2B、圖2D），說明香根草的根部是富集Mn的主要器官，劉云國等[22]的研究也表明香根草根部是Cd離子的主要富集部位。隨著Mn濃度的增加，根、葉中Mn含量表現出不一樣的變化。在30～120 mmol·L-1Mn處理下根中的Mn含量保持穩定（圖2A）。在15～60 mmol·L-1處理下葉中的Mn含量和轉移系數無顯著差異；但在120 mmol·L-1處理下，葉中Mn含量和轉移系數均出現大幅度的增加（圖2B、圖2D）。結果表明在一定Mn濃度內，香根草根、葉中的Mn離子并沒有隨著Mn處理濃度的增加而遞增。在木荷的根中也發現了類似的現象[16]。這可能是在高Mn環境中，香根草存在著限制Mn吸收和向葉片轉運的機制。在超高Mn濃度下（120 mmol·L-1），可能由于該機制受到破壞，才導致Mn離子向地上部位運輸增加，葉中Mn離子大量積累。

3.2 光合系統和礦質元素吸收對高Mn脅迫的響應

Mn過量會產生大量的活性氧，破壞葉綠素，影響PSⅠ與PSⅡ的活性，降低植物的光合速率[23]。水稻等農作物在Mn毒害下光合速率會顯著降低，光合系統的有關基因表達會發生改變[24-25]，本研究發現，香根草光合作用受抑制程度與Mn處理濃度、根、葉中Mn含量呈極顯著負相關（表1）。Pn顯著下降，Ci顯著增高（圖4A、圖4C），同時，ETRmax、Y（Ⅱ）也顯著下降（圖5B、圖5C），這說明造成香根草光合速率下降的主要因素并不是氣孔受限，而是光合系統和光合代謝活動受到了損傷。在Mn脅迫下，隨著光照強度的增加，Y（NO）保持穩定，而Y（NPQ）顯著增加（圖5D、圖5E），表明PSⅡ以熱耗散等保護性調節機制消耗的光能增加。Y（NPQ）的增加是植物的一種保護機制[26]。梁文斌等[19]也認為是Mn超積累植物垂序商陸的保護機制之一。

圖5 不同濃度Mn對香根草光系統Ⅱ最大光化學效率（Fv/Fm）、潛在最大相對電子傳遞速率（ETRmax）、光系統量子效率[Y（Ⅱ）]、光系統Ⅱ調節性能量耗散[Y（NPQ）]、光系統Ⅱ非調節性能量耗散[Y（NO）]的影響Figure 5 Effects of different concentrations of manganese on maximum photochemical efficiency（Fv/Fm），potential maximum relative electron conductivity（ETRmax），quantum efficiency of photosystem Ⅱ [Y（Ⅱ）]，down-regulation energy dissipation[Y（NPQ）]，non-light induced energy dissipation[Y（NO）]of vetiver grass

植物體內礦質元素平衡是其正常生長發育的必要條件，重金屬脅迫會改變植物體內礦質元素的吸收與分布[27]。本研究選取了大量元素K、中量元素Mg、微量元素Fe作為陽離子礦質元素的代表進行分析，結果顯示，在高濃度Mn脅迫下，植物體內的3種元素在根、葉中表現出不同的變化趨勢。在葉中，除K含量有一定程度的降低外（圖3A），Mg和Fe的含量基本維持穩定（圖3B、圖3C）。但在根中，K和Mg的含量均出現大幅度下降（圖3A、圖3B），而Fe則顯著增加（圖3C）。相關性分析發現，根、葉中的K含量和根中的Mg含量與根、葉中Mn的含量呈極顯著負相關（表1）。這可能是因為高Mn能抑制植物對K、Mg的吸收[28-29]。本試驗發現根、葉中K含量與植株干物質質量和Fv/Fm呈極顯著正相關（相關系數為0.675和0.674，0.772和0.750），暗示K營養在香根草耐受高Mn脅迫中具有重要的作用。此外，有研究發現Mn脅迫下Mn耐受型水稻根、葉中的Fe含量增加[28]。香根草根中Fe含量的增加可能是Mn耐受力強的表現。但有關機制還未見報道。

表1 處理溶液及根葉中Mn含量與香根草凈光合速率、根葉中K、Mg含量的相關系數Table 1 Correlation coefficients between Mn contents in solutions，roots，leaves and net photosynthetic rate or K and Mg contents in roots，leaves of vetiver grass

4 結論

香根草能夠長時間耐受60 mmol·L-1以下的Mn環境，并能夠在根、葉中積累高含量的Mn，具有修復Mn污染環境的潛力。限制Mn離子的吸收和轉運、增加PSⅡ調節性能量耗散消耗、維持葉中Mg、Fe的相對穩定是香根草對高Mn脅迫的適應性響應。