2株鄰苯二甲酸酯高效降解菌的篩選鑒定及其降解性能

潘 琪，孫 淑，周震峰，2*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，青島 266109；2.青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心，青島 266109）

鄰苯二甲酸酯（簡稱PAEs）是一類人工合成的有機化合物，主要被用作增塑劑和軟化劑，是塑料生產(chǎn)過程的重要化工原料。全球塑料制品的廣泛使用導(dǎo)致PAEs成為環(huán)境介質(zhì)中最普遍存在的有機污染物之一[1]。國內(nèi)外大量研究表明，PAEs具有內(nèi)分泌干擾性[2-3]，可通過呼吸、食物攝入和皮膚接觸進(jìn)入人體和動物體，干擾人類及其他動物正常的內(nèi)分泌活動，進(jìn)而影響生殖健康，威脅到人類及其他生物的生存[4-5]。

已有研究證實，PAEs屬于難降解有機污染物，在環(huán)境中水解、光解速度較慢，微生物降解是PAEs衰減的主要途徑[6]，馴化分離高效降解菌成為PAEs污染環(huán)境生物修復(fù)的重要基礎(chǔ)性工作[7-8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者選擇不同的PAEs化合物作為目標(biāo)污染物，從污泥、土壤、河道底泥等環(huán)境介質(zhì)中已經(jīng)成功分離出部分PAEs高效降解菌，包括Gordonia sp.[9]、Sphingobium sp.[10]、Enterobacter sp.[11]、Arthrobacter sp.[12-13]、Achromobacter insolitus[14]、Bacillus sp.[15]、Paenibacillus sp.[16]、Pseudomonas sp.[17-18]、Enterobacter sp.[17]、Rhodococcus sp.[17]、Ensifer sp.[19]、Pseudomonas putida[20]、Chryseobacterium sp.[21]、Mycobacterium sp.[22]、Xanthobacter sp.[23]。由于國內(nèi)外不同地域土壤和水體中PAEs濃度水平和單體組成存在顯著差異[24-25]，而已經(jīng)報道的PAEs降解菌適用環(huán)境條件有限，因此，仍有必要進(jìn)一步篩選高效廣譜的PAEs降解菌，為PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供更為豐富的菌種資源。

鑒于鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是目前我國土壤和水體中最主要的2種PAEs化合物[24]，故本文選擇DBP和DEHP作為目標(biāo)污染物，從土壤中篩選得到2株P(guān)AEs高效降解菌RXX-2和RXX-3，通過形態(tài)觀察、生理生化及16S rDNA序列分析等手段對菌株進(jìn)行了鑒定，并采用搖瓶振蕩培養(yǎng)考察了菌株在不同的環(huán)境條件下對PAEs的降解性能，旨在為菌株用于PAEs污染環(huán)境修復(fù)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

DBP和DEHP購自北京百靈威科技有限公司；高效液相色譜分析所用試劑均為色譜純，其余試劑均為分析純。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、蛋白胨 10.0 g，H2O 1000 mL。

無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0 g、NaCl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NH4NO30.5 g、CaCl20.1 g、FeCl3·6H2O 0.01 g，H2O 1000 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 PAEs降解菌的馴化與分離

從青島市設(shè)施菜地和白沙河沿岸采集土樣，稱10 g土樣分別加入盛有100 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，在30℃、175 r·min-1條件下振蕩混勻。按1%的接種量取上述樣品菌懸液的上清液，加入到DBP/DEHP分別為50 mg·L-1的無機鹽培養(yǎng)液中，避光振蕩培養(yǎng)7 d后進(jìn)行下一次傳代，每次傳代逐漸提高DBP和DEHP濃度，濃度系列遞增為50～1000 mg·L-1。每7 d作為一個馴化周期傳代一次，持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。取100 μL終期馴化液，涂布于DBP/DEHP濃度相同的無機鹽固體平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待長出肉眼可見菌落后，觀察其生長特征，篩選出長勢最好的菌株，挑取單菌落將其反復(fù)劃線接種于新的無機鹽固體培養(yǎng)基上，直至鏡檢純化為止。

1.2.2 菌株的鑒定

利用微生物生化鑒定試劑對菌株進(jìn)行生理生化特性的測定，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測定菌株的16S rRNA序列，并用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，對菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.3 菌懸液的制備

挑取新鮮單菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在搖床中28℃、170 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取出液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)液分裝于50 mL已滅菌的離心管中，在室溫條件下于4000 r·min-1離心分離10 min。棄去上清液后，使用滅菌的生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）重懸后再次離心，重復(fù)該過程3次后，用生理鹽水將菌體調(diào)配成菌懸液（OD600=1.0）。

1.2.4環(huán)境條件對菌株降解PAEs的影響

（1）pH。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP 無機鹽培養(yǎng)基中，用 0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為5、6、7、8、9，在接種量1.0%（體積比）、溫度25℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定剩余PAEs含量，并測定其OD600值。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，下同。

（2）溫度。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無機鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35 ℃，在接種量1.0%（體積比）、pH 7、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定剩余PAEs含量，并測定其OD600值。

（3）轉(zhuǎn)速。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無機鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置轉(zhuǎn)速0、100、150、175、200 r·min-1，在接種量為1.0%（體積比）、pH 7、溫度25℃的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定剩余PAEs含量，并測定其OD600值。

（4）接種量。將上述菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無機鹽培養(yǎng)基中，接種量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（體積比），在pH 7、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定剩余PAEs含量，并測定其OD600值。

（5）最佳條件下菌株對PAEs的降解性能。依據(jù)上述實驗確定的最佳降解條件，將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L-1DBP/DEHP無機鹽培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 d，分別在第1、2、3、4、5 d測定剩余PAEs含量。

1.2.5 PAEs含量的測定

采取液液萃取法對樣品中剩余PAEs進(jìn)行提取。向100 mL的DBP/DEHP無機鹽培養(yǎng)基中加入乙酸乙酯后振蕩30 min，全部移至分液漏斗充分振蕩后靜置分層，收集上層萃取液。用乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液至雞心瓶中，加入適量無水硫酸鈉去除水分。在玻璃砂芯漏斗中鋪一定量弗羅里硅土，用乙酸乙酯過濾并洗脫，收集全部洗脫液至雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入色譜級甲醇定容至1.5 mL，過有機系0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件為：色譜柱：inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm i.d.，5.0 μm）；流動相A：甲醇，流動相B：水。采用梯度洗脫：設(shè)定B起始為30%，在20 min內(nèi)勻速下降至5%，而后瞬間降至0%并保持5 min，再回到30%平衡10 min等待下一次進(jìn)樣；總流速：0.8 mL·min-1；柱溫箱溫度：32 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：228 nm。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計

利用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）以確定不同處理組之間的差異，顯著性水平為P＜0.05，利用軟件Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及生理生化鑒定

經(jīng)過富集培養(yǎng)，分離得到2株P(guān)AEs降解菌，分別命名為RXX-2、RXX-3。2株降解菌于30℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，對其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，詳見圖1。RXX-2菌落呈圓形，淡黃色，黏質(zhì)不透明，邊緣整齊，表面隆起，濕潤光滑，直徑一般在0.5～0.8 mm；RXX-3菌落呈圓形，白色，黏質(zhì)不透明，邊緣整齊，表面隆起，濕潤光滑，直徑一般在0.1～0.3 mm。

圖1 菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology

利用微生物生化鑒定試劑對2株降解菌的生理生化特性進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。由表可以看出，菌株RXX-2和菌株RXX-3的生理生化特性相似，葡萄糖發(fā)酵、阿拉糖發(fā)酵、檸檬酸鹽試驗呈陽性，半乳糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、肌醇發(fā)酵、山梨醇發(fā)酵、鼠李糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、密二糖發(fā)酵、色氨酸酶、丙酮酸酶、脲酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚、硫化氫、硝酸鹽試驗呈陰性，不同之處為菌株RXX-2的氧化酶試驗呈陽性，菌株RXX-3的氧化酶試驗呈陰性。

2.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

經(jīng)16S rDNA菌種鑒定，并繪制菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，RXX-2與食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）的相似性達(dá)到100%，RXX-3與鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）的相似性達(dá)到98%，綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步鑒定菌株RXX-2、RXX-3分別為食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）和鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）。

表1 2株降解菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of two degrading strains

2.3 環(huán)境條件對菌株降解PAEs的影響

2.3.1 pH對菌株降解PAEs的影響

pH對菌株降解PAEs的影響見圖3。由圖可知，在pH=5～9的范圍內(nèi)，隨初始pH升高，菌株RXX-2、RXX-3的生長量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但2株降解菌的最適pH條件略有不同。在初始pH=8條件下菌株RXX-2的生長和降解能力最強，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到32.5%和27.7%，而菌株RXX-3在初始pH=7條件下生長和降解能力最強，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到98.8%和25.3%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株RXX-2在中性偏堿性（pH=7、8、9）條件下對PAEs的降解率顯著高于酸性條件，這與文獻(xiàn)[26]報道的紅球菌（Rhodococcus sp.）相似，該菌株在中性偏堿性（pH=7、8）條件下生長降解狀況最佳，其原因可能是PAEs在降解過程中會代謝成鄰苯二甲酸、原兒茶酸等酸性物質(zhì)所致[27]，而菌株RXX-3在中性偏酸性（pH=5、6、7）條件下對PAEs的降解率顯著高于堿性條件，表明2株降解菌分別適于不同酸堿環(huán)境的PAEs污染修復(fù)。

2.3.2溫度對菌株降解PAEs的影響

溫度對菌株降解PAEs的影響見圖4。由圖可知，在培養(yǎng)溫度為15～35℃范圍內(nèi)，菌株RXX-2、RXX-3的生長量及PAEs的降解率隨溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。菌株RXX-2和RXX-3的最適生長溫度分別為25℃和30℃，溫度過低（15℃）會明顯影響菌株的生長，降解活性較低，當(dāng)溫度升至30℃時，PAEs降解率達(dá)到最高值，此時菌株RXX-2對DBP和DEHP降解率分別達(dá)到46.6%和31.2%，菌株RXX-3對DBP和DEHP降解率分別達(dá)到97.7%和43.7%，當(dāng)溫度繼續(xù)升至35℃時，DBP和DEHP的降解率均顯著低于30℃條件。該現(xiàn)象與其他學(xué)者[28-31]研究菌株在不同溫度條件下降解PAEs的結(jié)論一致，其原因可能是溫度會影響菌體的酶、核酸、蛋白質(zhì)等組分，繼而影響其細(xì)胞生長速率和生物化學(xué)反應(yīng)速率[32]。

圖2 菌株RXX-2和RXX-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain RXX-2 and RXX-3

圖3 pH對菌株降解PAEs的影響Figure 3 Effect of pH on degradation of PAEs by strains

2.3.3轉(zhuǎn)速對菌株降解PAEs的影響

轉(zhuǎn)速對菌株降解PAEs的影響見圖5。由圖可知，在轉(zhuǎn)速為0～200 r·min-1的范圍內(nèi)，菌株 RXX-2、RXX-3的生長量及PAEs降解率隨轉(zhuǎn)速的升高均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。菌株RXX-2和RXX-3分別在轉(zhuǎn)速 150 r·min-1和 175 r·min-1條件下生長量最高，但在轉(zhuǎn)速為175 r·min-1時2株降解菌均表現(xiàn)出最強的降解能力，菌株RXX-2對DBP和DEHP降解率分別達(dá)到50.2%和34.7%，菌株RXX-3對DBP和DEHP降解率分別達(dá)到87.5%和37.9%。由此表明，轉(zhuǎn)速過快或過慢都影響2菌株的生長，導(dǎo)致降解活性降低，這與周長健[33]分離的節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）JQ-1相似，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在150～175 r·min-1之間時，菌株的生長降解狀況最佳，其原因可能是由于搖床轉(zhuǎn)速間接地反映了培養(yǎng)液中溶解氧（DO）含量，提高轉(zhuǎn)速有利于空氣中的氧氣向培養(yǎng)基擴散，從而更好地滿足菌株生長代謝的需求，但當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時，菌株生長趨勢開始變得緩慢，可能是由于搖床振蕩過快造成菌株細(xì)胞破裂或培養(yǎng)液中DO已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[34]。

2.3.4接種量對菌株降解PAEs的影響

接種量對菌株降解PAEs的影響見圖6。由圖可知，在未接種降解菌的條件下，DBP和DEHP降解率很低，隨著菌液接種量的提高，2菌株的生長量及PAEs降解率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。菌株RXX-2、RXX-3均在接種量1.0%的條件下生長量最高，菌株RXX-2在接種量為1.5%時對PAEs的降解能力顯著高于其他接種量條件，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到43.9%和39.1%，而菌株RXX-3在接種量為1.0%時對PAEs的降解能力最強，DBP和DEHP降解率分別達(dá)到91.0%和42.4%，尤其是對DEHP的降解能力顯著高于其他的接種量條件。在正常情況下，菌液的接種量越高越有利于污染物的降解，但隨著接種量的不斷提高，較高的細(xì)菌數(shù)會形成對底物的競爭性利用，導(dǎo)致供單位微生物支配的營養(yǎng)物質(zhì)減少，從而部分細(xì)菌會死亡，菌株降解活性下降，故表現(xiàn)為菌株在較高接種量時對底物的降解率反而降低[35]。

圖4 溫度對菌株降解PAEs的影響Figure 4 Effect of temperature on degradation of PAEs by strains

圖6 接種量對菌株降解PAEs的影響Figure 6 Effect of inoculation amount on degradation of PAEs by strains

2.4 最佳條件下菌株對PAEs的降解性能

最佳條件下菌株對PAEs的降解性能見圖7。由圖可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株RXX-2、RXX-3對DBP和DEHP的降解率持續(xù)升高，第3 d時，菌株RXX-3對DBP的降解率已超過90%，到培養(yǎng)末期，菌株RXX-2和RXX-3對DBP的降解率分別達(dá)到71.43%和98.98%，對DEHP的降解率分別達(dá)到52.85%和62.96%。在整個培養(yǎng)期，菌株RXX-3對DBP和DEHP的降解能力始終高于菌株RXX-2，且DBP的降解率始終高于DEHP，這主要是由于DBP的分子摩爾質(zhì)量（278.4 g·mol-1）和lgKow（4.45，Kow為辛醇-水分配系數(shù)）均小于DEHP（分別為390.6 g·mol-1、7.50），而水溶解度（11.2 mg·L-1）高于 DEHP（0.003 mg·L-1）[2]，導(dǎo)致其微生物利用率相對較高，降解速率較快。

圖7 最佳條件下菌株對PAEs的降解性能Figure 7 Degradation rates of strains to PAEs under the optimal conditions

3 結(jié)論

（1）從土壤中分離得到2株P(guān)AEs降解菌RXX-2、RXX-3，初步鑒定2菌株分別為食異源物鞘氨醇菌（Sphingobium xenophagum）和鰻敗血假單胞菌（Pseudomonas anguilliseptica）。

（2）菌株RXX-2降解PAEs的最佳條件為pH 8、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.5%，而菌株RXX-3的最佳條件為pH 7、溫度30℃、轉(zhuǎn)速175 r·min-1、接種量1.0%。

（3）在最佳降解條件下，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，菌株RXX-2對DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到71.43%和52.85%，RXX-3對DBP和DEHP的降解率分別達(dá)到98.98%和62.96%，表明篩選得到的2株降解菌在PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景。