Box-Behnken模型響應(yīng)面法優(yōu)化以玉米芯為基質(zhì)培養(yǎng)黑曲霉孢子的工藝

楊海雁，于喆源

（張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院，甘肅張掖734000）

檸檬酸是當(dāng)代日常生活中應(yīng)用最多，并具有重要商業(yè)價值的有機(jī)酸，由于其具有良好的安全性能、風(fēng)味及金屬螯合能力以及緩沖能力，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑和化妝品等領(lǐng)域，其中64%的檸檬酸應(yīng)用于食品飲料，22%應(yīng)用于去垢劑和洗滌劑，約10%應(yīng)用于醫(yī)藥和營養(yǎng)品，2%應(yīng)用于化妝品[1]。此外，檸檬酸也是重要的化工原料，用于合成聚合物[2]，應(yīng)用于納米醫(yī)學(xué)[3]和組織工程學(xué)等領(lǐng)域[4]。全球產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到170 萬噸，并且其需求正以每年3.5%～4.0%的速度增長[5]。我國是檸檬酸的主要生產(chǎn)國和出口國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的53%[6]。

我國檸檬酸生產(chǎn)工藝廣泛使用黑曲霉（Aspergillus niger）做生產(chǎn)菌種。作為非常重要的檸檬酸生產(chǎn)菌種，它可以利用不同的底物生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)酸率高，副產(chǎn)物較少。但是黑曲霉菌株的產(chǎn)酸能力和產(chǎn)酸營養(yǎng)條件是制約檸檬酸生產(chǎn)能力的瓶頸[7]。國內(nèi)外關(guān)于黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的研究比較多，但是主要集中在高產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵原料的研究、發(fā)酵過程優(yōu)化等，關(guān)于營養(yǎng)物質(zhì)對黑曲霉產(chǎn)孢能力影響的研究較少[8]。黑曲霉的產(chǎn)孢能力直接影響產(chǎn)生的黑曲霉的數(shù)量進(jìn)而影響其產(chǎn)檸檬酸的能力。據(jù)資料顯示[9]，玉米芯中含有豐富的適宜黑曲霉生長的營養(yǎng)物質(zhì)，因此本研究嘗試以玉米芯作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，比較分析葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖等5 種碳源，玉米漿、麩皮浸出液、硫酸銨、氨水等6 種氮源以及碳源和氮源濃度對黑曲霉產(chǎn)孢能力的影響，篩選產(chǎn)孢能力最強(qiáng)的碳源，并確定其最佳添加量；以確定的碳源為基礎(chǔ)，并在此基礎(chǔ)上，通過進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，以黑曲霉孢子的數(shù)目為響應(yīng)值，以上述條件為影響因素，找到黑曲霉孢子生長的最佳條件，以期對黑曲霉孢子的進(jìn)一步研究及利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉（編號：CMCC（F）98003）：中國食品藥品檢定研究院；葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、糊精、硫酸銨、氨水（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米芯顆粒、玉米漿、麩皮、花生餅粉、黃豆餅粉：張掖市綠洲農(nóng)貿(mào)交易市場。

1.2 儀器及設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SPX-250）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE E200）：尼康公司；立式高壓滅菌鍋（LMQ.C）：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；生物安全柜（BHC-1300ⅡA2）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；血細(xì)胞計數(shù)板（XB-K-25）：玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠；電子天平（PLI502-S）：梅特勒-托樂多公司；全自動定氮儀（SPD80）：北京三品科創(chuàng)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備

取粉碎的玉米芯粉100 g 放入250 mL 的錐形瓶中，加入180 mL 純化水，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3.2 孢子懸液制備

在無菌條件下用移液槍移取1.0 mL 孢子液至已滅菌的培養(yǎng)基中，玻璃珠打散后，用無菌水稀釋至合適的倍數(shù)用于計數(shù)。

1.3.3 培養(yǎng)方法

將“1.3.2”項(xiàng)下加好孢子懸液的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng) 7 d。

1.3.4 玉米芯基本性質(zhì)的測量

通過采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖》測定[10]，NY/T 2017-2011《植物中氮、磷、鉀的測定》[11]標(biāo)準(zhǔn)中對總糖及氮元素的測量方法，確定試驗(yàn)用玉米芯中總糖含量56.0%，總氮含量1.6%。

1.3.5 孢子數(shù)的測定

將清潔干燥的25 mm×16 mm 血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再在蓋玻片邊緣滴一小滴搖勻的孢子懸液，讓孢子液沿縫隙靠毛細(xì)作用自動進(jìn)入計數(shù)室，計數(shù)室內(nèi)不可有氣泡。加樣后靜置5 min，待孢子沉降，然后將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，找到計數(shù)室進(jìn)行計數(shù)。位于計數(shù)格劃線上的孢子，取兩邊計數(shù)，另外兩邊不計。記下4 個角4 個大格和中央一大格的孢子數(shù)。每次重復(fù)觀察計數(shù)不少于2 次，然后取平均值。計算可得每毫升孢子液中孢子數(shù)目。

1.3.6 麩皮浸出液制備

稱取50 g 市售麩皮于500 mL 錐形瓶中，加入100 mL 純化水，靜置15 h，用兩層紗布過濾，濾液待用。

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計

黑曲霉生長的條件除了適宜的溫度和濕度，最重要的就是碳源和氮源，因此本試驗(yàn)分別考察不同種類的碳源、氮源以及碳源濃度、氮源濃度，對黑曲霉在“1.3.1”所述玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中產(chǎn)孢能力的影響。在無菌條件下用移液槍移取1.0 mL 稀釋好的孢子液于已滅菌的培養(yǎng)基中，按表1 所示，進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計Table 1 Design of single-factor experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源種類的確定

在以玉米漿為氮源，玉米漿濃度0.45%，碳源濃度0.7%，其他因素不變的條件下，分別按表1 所示，選取不同碳源加入玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌30 min 后進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源種類對黑曲霉孢子生長的影響（n=3）Fig.1 Effect of carbon source type on growth of Aspergillus niger spores（n=3）

由圖1 可見，添加碳源的種類不同，黑曲霉產(chǎn)孢能力亦不同。當(dāng)碳源為蔗糖時，黑曲霉孢子數(shù)達(dá)到最大值；當(dāng)碳源為淀粉和糊精時，黑曲霉孢子數(shù)明顯較小，蔗糖的產(chǎn)孢能力較其他糖高出11%～101.2%。原因可能是黑曲霉易于快速吸收單糖，蔗糖是雙糖其水解變?yōu)槎肿拥膯翁牵袉翁堑臐舛容^高，能為黑曲霉提供足夠的碳源，更利于黑曲霉孢子的生長[12-13]；而淀粉、糊精是多糖化合物，其成分復(fù)雜且粘稠，致使溶解氧較少，有礙于黑曲霉的生長，且糊精在水中的粘性比淀粉大，故使黑曲霉孢子更難以利用[14-15]。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，添加碳源種類選取蔗糖為中心值。

2.1.2 碳源濃度的篩選

在玉米漿為氮源，氮源濃度0.45%，蔗糖為碳源，其他因素不變的條件下，分別按表1 所示，選取不同濃度的碳源加入玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌30 min后進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 碳源濃度對黑曲霉孢子生長的影響（n=3）Fig.2 Effect of carbon source concentration on growth of Aspergillus niger spores（n=3）

由圖2 可見，隨著碳源濃度的增加，黑曲霉產(chǎn)孢能力先增大后減小。當(dāng)碳源濃度為0.75%時，黑曲霉孢子數(shù)達(dá)到最大值；當(dāng)碳源濃度為0.25%時，黑曲霉孢子數(shù)為最小值。原因可能是黑曲霉適合在較高濃度的碳源中生長，濃度過低時不能為其生長提供足夠的能量，而濃度過高時因?yàn)楦邼B透壓等原因?qū)ζ渖L起抑制作用[16-17]，不利于黑曲霉孢子的產(chǎn)生。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，以添加濃度為0.75%的蔗糖為中心值。

2.1.3 氮源種類的確定

在以蔗糖為碳源，碳源濃度為0.75%，氮源濃度0.45 %，其他因素不變的條件下，分別按表1 所示，選取不同氮源加入玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌30 min 后進(jìn)行試驗(yàn)，其中麩皮浸出液按方法1.3.6 進(jìn)行制備，結(jié)果見圖3。

由圖3 可見，氮源的種類不同，黑曲霉產(chǎn)孢能力亦不同。其中當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時，黑曲霉孢子數(shù)達(dá)9.1×107個，當(dāng)?shù)礊榘彼畷r黑曲霉孢子數(shù)達(dá)7.1×107個，兩者處于同一數(shù)量級。但較其他有機(jī)類氮源高出29%～103%。無機(jī)氮源的產(chǎn)孢能力明顯大于有機(jī)氮源。原因一方面可能是無機(jī)氮源成分比較單一，且氮元素以銨根離子的形式在培養(yǎng)基中游離，黑曲霉孢子能夠快速吸收利用；另一方面可能是無機(jī)氮源能夠影響培養(yǎng)基的pH 值，使其更符合黑曲霉的最佳生長條件[3]。而有機(jī)氮源成分復(fù)雜，氮元素主要以化合態(tài)的形式存在，黑曲霉吸收利用較慢[18]。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，添加氮源種類選取硫酸銨為中心值。

圖3 氮源種類對黑曲霉孢子生長的影響（n=3）Fig.3 Effect of nitrogen source type on growth of Aspergillus niger spores（n=3）

2.1.4 氮源濃度的篩選

在硫酸銨為氮源，蔗糖為碳源，碳源濃度0.75%，其他因素不變的條件下，分別按表1 所示，選取不同濃度的氮源加入玉米芯基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌30 min 后進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 氮源濃度對黑曲霉孢子生長的影響（n=3）Fig.4 Effect of nitrogen source concentrtion on growth of Aspergillus niger spores（n=3）

由圖4 可見，隨著氮源濃度增加，黑曲霉產(chǎn)孢能力先增大后減小。當(dāng)?shù)礉舛葹?.50%時，黑曲霉孢子數(shù)達(dá)到最大值，培養(yǎng)效果最佳。原因可能是當(dāng)?shù)礉舛冗^低時不能滿足黑曲霉孢子正常生長所需，當(dāng)?shù)礉舛冗^高時由于溶液中離子濃度增大、pH 值變化等對黑曲霉孢子的生長起抑制作用[19-20]，不利于黑曲霉孢子生長。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，以添加濃度為0.50%的硫酸銨為中心值。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，氮源種類的不同對黑曲霉孢子的生長有顯著的影響，硫酸銨明顯優(yōu)于其他種類氮源，所以在后續(xù)試驗(yàn)中，確定硫酸銨為氮源種類。選取2.1 項(xiàng)下碳源種類、碳源濃度、氮源濃度3 種因素為變量，運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計模型，以黑曲霉孢子數(shù)為響應(yīng)值，通過建立響應(yīng)面，得到黑曲霉孢子數(shù)與各因素變量的多項(xiàng)式方程，得出培養(yǎng)黑曲霉孢子的最佳條件。

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的建立

根據(jù)2.2 所述，選擇碳源種類、碳源濃度、氮源濃度3 種因素為變量，建立三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平編碼表如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平Table 2 Analytical factors and levels of response surface experiemtns

采用Design-Expert8.0 軟件，按照Box-Behnken組合設(shè)計[21-23]，依據(jù)表2 所示因素水平設(shè)計試驗(yàn)方案，結(jié)果見表3，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果（n=3）Table 3 Desing and results of response surface experiemtns（n=3）

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

采用Design-Expert8.0 軟件對響應(yīng)值與各因素編碼值進(jìn)行回歸擬合后得到黑曲霉孢子數(shù)與各變量的二次多項(xiàng)式方程模型為：R=93.95-0.013A+4.89B-3.23C+3.60AC+1.10BC-3.72B2-1.94C2。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表4 可以看出，失擬項(xiàng) P=0.076 8＞0.05 不顯著，說明該模型擬合良好；模型的均方差P=0.000 1＜0.01，表明回歸模型極顯著；決定系數(shù)R2=0.968 1，校正系數(shù)Adj R2=0.926 3，說明選定因素對模型變化有較高相關(guān)性，模型對實(shí)測值具有較高的解釋性，預(yù)測值具有較高可信度，可用此模型進(jìn)行預(yù)測；變異系數(shù)CV %=1.49%，表明在該試驗(yàn)條件下，變異程度較小，具有較好的可重復(fù)性。由回歸模型顯著性分析可知：在選取的3 種考察因素中，碳源濃度和氮源濃度對黑曲霉孢子的產(chǎn)生有非常顯著的影響，碳源種類與氮源濃度、碳源濃度和氮源濃度交互影響明顯，其原因可能是，黑曲霉能快速吸收利用單糖，且其適宜在碳源濃度較高的環(huán)境中生長，氮源在選擇使用硫酸銨時，其濃度能夠明顯影響培養(yǎng)基的pH 值，而黑曲霉在培養(yǎng)基pH=5 左右時生長最佳。所以碳源種類及濃度與氮源濃度存在明顯的的交互交互關(guān)系，對黑曲霉孢子的產(chǎn)生有明顯的影響[3，24]。其中，碳源種類與氮源濃度，碳源濃度和氮源濃度交互回歸優(yōu)化響應(yīng)面如圖5、圖6所示。

2.2.3 優(yōu)化條件的選取

根據(jù)模型預(yù)測，在以玉米芯和純化水作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉孢子的最佳條件為：碳源種類為果糖，碳源濃度0.660%，氮源濃度0.278%，理論預(yù)測黑曲霉孢子數(shù)為9.57×107個。考慮到實(shí)際操作的可行性，確定最佳培養(yǎng)條件為：碳源種類為果糖，碳源濃度0.70 %，氮源濃度0.30%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3 次平行實(shí)驗(yàn)測得黑曲霉孢子數(shù)為9.48×107，9.61×107，9.57×107個，與模型預(yù)測值接近，表明模型能較好的預(yù)測黑曲霉孢子的生長情況。

圖5 碳源種類與氮源濃度交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of interaction between carbon source type and nitrogen source concentration

圖6 碳源濃度與氮源濃度交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of interaction between carbon source concentration and nitrogen source concentration

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終確定對不同碳源種類，碳源濃度，氮源濃度3 個影響因素來考察對黑曲霉孢子生長的影響，建立的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型具有良好的顯著性。通過軟件擬合結(jié)合實(shí)際，確定最佳培養(yǎng)條件為：碳源種類為果糖，碳源濃度0.70%，氮源濃度0.30%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，證明該模型擬合情況良好，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉孢子培養(yǎng)工藝切實(shí)可行。同時，該方法操作便捷、高效，且基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品玉米芯作為原料，為農(nóng)副產(chǎn)品的再利用提供了理論依據(jù)。