鹿科不同物種血液的分子鑒定

周辰杰，黨 平，周翠霞，張曉晨

（1.蘇州紅冠莊國藥股份有限公司，江蘇 昆山 215343；2.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203）

鹿血為鹿科動物的血液，鹿種的基源產自我國東北地區，據《本草綱目》記載：“鹿血主陽痿、補虛、止腰痛、鼻衄、跌傷、狂犬傷，和酒服治肺痿吐血，及崩中帶下，諸氣痛欲危者飲之立愈。大補虛損，益精血，解痘毒、藥毒”。鹿血來源于《中國藥典》鹿茸基源梅花鹿Cervus nipponTemminck 或馬鹿Cervus elaphusLinnacus 的新鮮血液，作為珍貴的中藥材在藥用或功能性食品方面被廣泛認可，如鹿血酒、鹿血晶等制品。鹿血飲片含有多種活性成分，并且在人類血液系統疾病和惡性腫瘤的治療中取得良好效果［1-4］，其中也包含臨床研究報道［5-6］。因鹿血產品較昂貴，也成為了不法分子造假或者以次充好的對象，近年來有了一些對鹿血真偽和品質檢測的文獻報道，但結果仍存在一定偏差［7］。為了確保鹿血的真實度和純度，從源頭上控制鹿血的品質，課題組在相關鹿血鑒別文獻［8-9］的基礎上采用聚合酶鏈式反應技術（PCR）成功鑒別了包括基源藥材梅花鹿血在內的10 種常見物種（鹿、豬、馬、驢、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝）血液樣本線粒體DNA 序列上的差異，并且方法簡便快速［10-11］，以期為制定鹿血飲片的炮制規范提供依據。

聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定DNA 片段的分子生物學技術，是生物體外的特殊DNA 復制，其最大優勢便是將微量樣品中的DNA 片段大幅增加，從而達到放大核酸信號的目的。PCR 具有極高的反應靈敏性和特異性，能夠區分少至幾個核苷酸堿基的差異，無論是化石中的古生物、或是幾十年前兇殺案遺留的殘骸，只要分離出微量的DNA，就能以PCR 技術放大，進行比對。由于進化過程中不同物種的遺傳物質DNA 存在序列上的保守和多變性，因此物種之間存在一定的差別，其中線粒體DNA 相對基因組DNA 具有更高的突變率和遺傳多變性，因此線粒體DNA序列上的差別及其特異性便更多地運用于不同物種、相近物種及物種內部的進化分析和診斷檢驗［12-14］。

本課題組采用PCR 技術不但鑒定了鹿血和其他常見家畜家禽血液線粒體DNA 序列的不同，同時也以此技術鑒別了4 個鹿科物種（東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿，其中東北馬鹿、塔河馬鹿為馬鹿的2 個亞種，共5 種鹿科動物血液）在該序列上的差異，也為來源于不同鹿科物種的血液鑒別提供了依據。

1 材料與方法

1.1 鹿血晶制備 取鹿科動物梅花鹿Cervus nipponTemminck 或馬鹿Cervus elaphusLinnacus 的新鮮血液，勻漿，過濾，濾液噴霧，凍結，依法循環操作，使凍結物至一定厚度，冷凍干燥，干燥品表面呈紫紅色或紫黑色、具晶體光澤、大小不一的碎片。樣本由蘇州紅冠莊國藥股份有限公司提供。

1.2 動物樣本 東北梅花鹿（Cervus nipponTemminck）、東北馬鹿（Cervus elaphusXanthopygus）樣本為鮮血，血液樣本中均添加抗凝劑，于-20 ℃保存；塔河馬鹿（Cervus elaphusYarkandensis）、坡鹿（Cervus eldii）樣本為血干粉，白唇鹿（Cervus albirostris）樣本為毛發（此樣本來源見討論部分）；鹿血晶DNA 模板取樣于鹿血晶中藥飲片；所有動物血液樣本均采自蘇州紅冠莊國藥股份有限公司長春分公司，國家重點保護野生動物馴養繁殖許可證號林護馴繁（吉）2014-55。

1.3 引物 供本實驗鑒定用的引物體系以對比各物種線粒體DNA（mtDNA）上的D-loop 區序列進行設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成。序列見表1。

1.4 試劑 DNA 抽提試劑盒（德國Qiagen 公司）；預混Taq 酶（天津市萊博科技有限公司）；瓊脂糖（德國Sigma公司）；磷酸緩沖液；溴化乙錠；50 bp DNA 分子標記［天根生化科技（北京）有限公司］；電泳緩沖液。

表1 鑒定用引物體系的特異性引物序列

1.5 儀器 Sigma 1-14 臺式離心機（德國Sigma 公司）；Bio-Rad T-100PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；HE-120 水平電泳儀、UV-2000 凝膠紫外分析割膠儀（上海天能科技有限公司）。

1.6 試劑制備 溴化乙錠貯備液10 mg／mL；磷酸緩沖液（NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.42 g、KH2PO40.27 g，加水至1 L，調pH 7.4）；電泳緩沖液（Tris 121 g、EDTA 11.5 g、冰醋酸28.55 mL，加水至500 mL）。

1.7 鹿鮮血樣本DNA 模板提取［8，13-14］按文獻［5］的鮮血樣本提取方法，使用“DNeasy? Blood ＆ Tissue Kit”試劑盒，或“TIANamp Genomic DNA Kit”試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取動物血液樣本200 μL，置于1.5 mL離心管中，依次加入蛋白酶K、AL 裂解緩沖液，分別吹打混勻；56 ℃水浴保溫10 min；加入無水乙醇，吹打混勻，進樣至DNA 純化柱中，8 000 r／min 離心1 min；棄過濾液，分別加入AW1、AW2 漂洗液，8 000、14 000 r／min 離心1、3 min；棄去過濾液，再離心1 min，將DNA 純化柱移入新1.5 mL 離心管中，加入洗脫緩沖液，室溫放置1 min 后，8 000 r／min離心1 min，取洗脫下的DNA 溶液，作為供試品溶液，置-20 ℃保存備用。

1.8 鹿血晶樣本DNA 模板提取［10，15］使用DNeasy?Blood ＆ Tissue Kit 或TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取鹿血晶20 mg，置1.5 mL 離心管中，加入磷酸鹽緩沖液振蕩溶解，加入蛋白酶K、AL 裂解緩沖液吹打混勻，56 ℃水浴保溫10 min，之后按“1.7”項下方法提取。

1.9 鹿毛發樣本DNA 模板提取 使用DNeasy? Blood ＆Tissue Kit 試劑盒，以柱親和層析法提取DNA。取鹿毛發20 mg，剪碎，置1.5 mL 離心管中，用75%乙醇清洗2 次，再用雙蒸水清洗3 次，加入ATL 緩沖液、蛋白酶K 吹打混勻，于56 ℃ 水浴消化過夜，之后按“1.7”項下方法提取。

1.10 PCR 反應體系和反應條件 在200 μL 薄壁管中進行PCR 反應，反應體系的總體積為10 μL，包括預混Taq 酶5 μL、鑒別引物正反向各1 μL、DNA 模板1 μL、雙蒸水2 μL。將離心管置PCR 儀，PCR 反應參數為94 ℃預變性5 min，循環反應35 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

1.11 電泳檢測 采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產物，瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，凝膠中加入核酸染色劑溴化乙錠；PCR 反應液的上樣量為8 μL，DNA 分子量標記上樣量為5 μL（0.08 μg／μL）。在120 V 下電泳約30 min。完成電泳后，在紫外透射儀或凝膠成像儀上對凝膠片進行檢測。

1.12 PCR 檢測 將5 種鹿科物種的DNA 模板按相同比例混合，即各組分的占比為20%，作為PCR 反應的模板。在200 μL 薄壁管中進行PCR 反應，反應體系的總體積為10 μL，包括預混Taq 酶5 μL、鑒別引物正反向各1 μL、混合模板1 μL、雙蒸水2 μL。將離心管置于PCR 檢測儀，PCR 反應參數為94 ℃預變性5 min，循環反應40 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

1.13 測序與BLAST

制備測序樣品的PCR 反應總體積為20 μL，反應體系包括Taq 酶10 μL、鑒別引物正反向各2 μL、DNA 模板2 μL、無菌雙蒸水4 μL。將離心管置PCR 儀上，反應參數為94 ℃預變性5 min，循環反應40 次（94 ℃，45 s；56 ℃，45 s；72 ℃，45 s），延伸（72 ℃）10 min。

PCR 反應結束后，從每一管預測序樣品中吸取5 μL 電泳檢測，沒有問題便提交測序公司測序。同時，需提交測序樣品所使用的正反向引物各10 μL，濃度5 μmol／L。

將正反向測序結果拼接，作為最終測序結果，使用BLAST 工具對測序結果進行數據庫比對。

2 結果

2.1 PCR 結果 見圖1～2。

2.2 方法學考察

2.2.1 重復性考察 將同批次的供試品以相同的PCR 反應體系及反應條件重復進行6 次上述PCR 實驗。結果見圖3～8。

東北梅花鹿的特異性引物僅對東北梅花鹿DNA 模板特異性擴增出247 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結果一致。

東北馬鹿的特異性引物僅對東北馬鹿DNA 模板特異性擴增出164 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結果一致。

圖1 各樣品DNA 模板特異性擴增條帶

圖2 5 種鹿的特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

塔河馬鹿的特異性引物僅對塔河馬鹿DNA 模板特異性擴增出299 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結果一致。

坡鹿的特異性引物僅對坡鹿DNA 模板特異擴增出401 bp大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結果一致。

白唇鹿的特異性引物僅對白唇鹿DNA 模板特異性擴增出534 bp 大小的條帶，而其他物種DNA 模板無擴增，6 次實驗結果一致。

各種鹿科物種的特異性引物都能從混合模板中擴增出相對應的鹿科物種特異性大小條帶，6 次實驗結果一致。

綜上所述，東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系都表現了很好的一致性，所有陽性、陰性結果都能夠重復。

2.2.2 重復性試驗 通過3 家實驗室以相同的方法、條件進行試驗，來考察東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系的重復性。

2.2.3 中間精密度試驗 同一實驗室的不同人員，在不同時間進行試驗，對東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系進行中間精密度考察，上述重復性試驗便是由不同的人員在不同的時間內完成。結果顯示，均能再現一致的試驗結果，驗證了梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系的中間精密度。

3 討論

由于前期的鹿和其他9 種家畜家禽鑒定用引物體系中的鹿引物無法對于不同鹿種進行鑒別［7］，于是課題組建立了這套針對不同鹿種的引物體系，用來鑒別正品鹿血、正品鹿血藥材和飲片的具體來源。

圖2 顯示，使用東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿鑒定用引物體系來對鹿血晶DNA 模板擴增，其中東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿的引物都能夠從鹿血晶DNA 模板中擴增出條帶，而坡鹿和白唇鹿的引物無此條帶，表明鹿血晶的原料來源為梅花鹿和馬鹿的血液，其中并不含坡鹿和白唇鹿這兩種國家保護動物的血液。

白唇鹿屬于我國一級保護動物，僅分布于青藏高原，樣本采集困難，課題組從位于四川西部的新路海白唇鹿自然保護區中采集到了毛發樣本，從中提取DNA 來進行研究。

圖3 東北梅花鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖4 東北馬鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖5 塔河馬鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖6 坡鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖7 白唇鹿特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

圖8 5 種鹿科物種特異性引物PCR 擴增DNA 條帶

由于該物種數量不多，因此在GenBank 數據庫中的序列數據相比其他鹿種要少很多。在設計引物時課題組發現，即使在GenBank 有限的白唇鹿序列中，也出現了2 套不一樣的數據，其中之一為四川大學所提交的HM049636.1 等，另一套為法國和吉林的研究者提交的JN632690.1 與GQ304765.1 等，這2 套不同的序列經過對比表現出了很大的不一致性，其區別已經和其他同屬不同種的鹿物種之間的序列差別相當。課題組無法設計一套引物來涵蓋這2 種白唇鹿并將其與其他鹿種區分開來，于是根據這2 套數據分別設計了引物。

通過PCR 實驗以及測序驗證，課題組從新路海所采集的白唇鹿標本能夠匹配上述后一套數據，既法國和吉林的研究者所提交的數據；自然PCR 產物的測序結果與四川大學所提交的序列有較大不同，因此根據這套序列所設計的引物是無法從所采集的白唇鹿標本中擴增出條帶的。課題組所提交的引物體系中的白唇鹿引物是經過驗證，能夠從所采集到的白唇鹿樣本中擴增出條帶的引物。

從目前所掌握的情況看，白唇鹿物種應該沒有分亞種，因此其個體間的序列差別不應該像上述2 套序列數據之間的差別那么顯著。至于為什么會出現這種情況，并不在課題組這系列實驗的研究范圍內，課題組也沒有資源在短時間內完全解決這個疑問。

本研究建立了針對不同鹿科物種的鑒定引物體系，能夠鑒別東北梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、坡鹿、白唇鹿，通過PCR 實驗、測序、方法學驗證，證明了該體系的有效性和可靠性。