固相萃取LC-MS/MS法測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度*

王獻瑞 ，趙西子 ，王曉明 ，郭亞卿 ，潘桂湘 ，黃宇虹

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室（培育），天津 301617；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

疏血通注射液是由水蛭[1-2]、地龍[3-4]兩味動物類中藥經低溫提取和膜分離等工藝制成的中藥復方制劑[5]，具有活血化瘀、通經活絡的功效，臨床常用于瘀血阻絡所致的缺血性中風病中經絡急性期，癥見半身不遂、口舌歪斜、語言謇澀[6-7]。疏血通注射液化學成分復雜，含有多肽、多糖、氨基酸、次黃嘌呤等物質[8-10]，目前其真正發揮藥效作用的物質基礎尚不明確。據文獻報道[11-12]，次黃嘌呤具有明確的生物活性，能透過細胞膜進入細胞內，提高多種酶的活性，參與機體一些重要生理機能的調節。因此，本文以次黃嘌呤為指標成分，建立液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法對其進行定量分析，以期為疏血通注射液質量分析、評價以及質量標準的制定提供參考和依據。

目前，疏血通注射液中次黃嘌呤的測定，采用的大多是高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）[13-14]，檢測波長為254 nm。由于疏血通注射液中眾多成分在254 nm處具有紫外吸收，需進行長達50 min的梯度洗脫，使次黃嘌呤與注射液中的其他干擾物質實現完全的色譜分離，次黃嘌呤出峰時間為13min，整個分析周期相對較長[15]。LC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度、高準確性的特點[21]，尤其是具有獨特的質量分辨能力，能在復雜基質中專屬、靈敏、準確地檢測某個或某幾個成分。本研究采用固相萃取LC-MS/MS法測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度，分析時間縮短至3.50 min，次黃嘌呤出峰時間為1.02 min，可較大程度提高分析的效率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國waters公司），Waters Xevo TQ-S三重串聯四極桿質譜儀（美國waters公司）；MiniSpin Plus高速離心機（德國Eppendorf公司），AX205十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Synergy UV超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試劑和藥品 疏血通注射液（牡丹江友博藥業股份有限公司）。次黃嘌呤標準品（德國Sigma公司，純度99%以上），6-巰基嘌呤標準品（德國Aldrich公司，純度98%以上）。甲醇（色譜純，德國Sigma公司），甲酸（色譜純，ROE公司），超純水為Millipore超純水系統制得。Sep-pak C18固相小柱（500 mg，waters公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀系統：二元泵系統、自動進樣器、柱溫箱，Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分析柱，BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）保護柱；流動相為甲醇（A），0.1%甲酸水（B），流速：0.3 mL/min；柱溫40℃，進樣量2 μL，分析時間為3.50 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜條件梯度洗脫程序表

2.2 質譜條件 Waters Xevo TQ-S三重四極桿質譜，ESI負離子模式，MRM掃描方式。參數設置：毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，氮氣壓力7 psi，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣流速150 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min。化合物MRM方法參數見表2。

表2 次黃嘌呤與內標的MRM方法參數

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取次黃嘌呤適量，加甲醇制成100 μg/mL的次黃嘌呤儲備液；另稱取內標6-巰基嘌呤適量，少量甲醇溶解后用甲醇-水（含0.2%甲酸）（2∶8） 配制成 125 μg/mL 的 6-巰基嘌呤儲備液。用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀釋上述儲備液，制得含次黃嘌呤系列濃度 500、400、300、200、100 ng/mL的混合對照品溶液（含內標250 ng/mL）。2.3.2 供試品溶液制備 精密移取100 μL疏血通注射液和100 μL濃度為125 μg/mL的6-巰基嘌呤溶液，加于已活化的C18固相萃取小柱上，用300 μL水洗除雜，再用 1.00 mL 甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）洗脫，取洗脫液 100 μL 用甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）稀釋 10倍，搖勻，再取 200 μL用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀釋5倍，混勻，即得。

2.3.3 陰性對照液制備 取1 mL疏血通注射液，加黃嘌呤氧化酶37℃水浴溫孵2h，精密移取100μL經酶促反應后的疏血通注射液，加于C18固相萃取小柱上，其余按“2.3.2”項下方法操作，制成不含次黃嘌呤的陰性對照液。

2.4 專屬性試驗 取陰性對照液、對照品溶液和供試品溶液分別進樣測定，次黃嘌呤、6-巰基嘌呤色譜峰形良好，測定無干擾，次黃嘌呤保留時間為1.02 min，6-巰基嘌呤保留時間為1.22 min，結果見圖1。

圖1 疏血通注射液中次黃嘌呤及內標的MRM色譜圖

2.5 線性關系考察 吸取“2.3.1”項下系列濃度混合對照品溶液，進樣2 μL測定，以次黃嘌呤質量濃度（X）為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y=4.299×10-3X+9.246×10-3，r=0.999，表明次黃嘌呤在0.1～0.5 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 精密度實驗 精密吸取對照品混合溶液2 μL，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，測得次黃嘌呤與內標峰面積比值，相對標準偏差（RSD）為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性實驗 精密移取同一批號的疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”項制備供試品溶液，平行6份，進樣測定，RSD為0.86%，表明樣品重現性良好。

2.8 穩定性實驗 室溫下，精密吸取同一供試品溶液 2 μL，分別在 0、2、4、6、8、12、24、48 h 進樣，測次黃嘌呤與內標峰面積比值，RSD為0.84%。結果表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.9 加樣回收率實驗 精密移取同一批號已知含量的疏血通注射液6份，每份50 μL，精密加入濃度為 200 ng/mL 的對照品溶液 28 μL，按“2.3.2”項下處理與測定，計算回收率，結果見表3。

表3 次黃嘌呤加樣回收率試驗結果（n=6）

2.10 樣品濃度測定 分別精密移取各批號疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，內標法計算次黃嘌呤濃度，結果見表4。

3 討論

3.1 流動相的選擇 實驗分別考察了乙腈-水和甲醇-水等流動相系統，結果發現當使用乙腈-水或乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動相時，次黃嘌呤峰形尖而細，但主峰后出現一個小的裂分峰；當使用甲醇-水為流動相時，次黃嘌呤峰形較寬，且裂分為兩個大小相當的雙峰，但若將水相改為0.1%甲酸水時，即以甲醇-水（含0.1%甲酸）為流動相，峰形對稱尖銳且未出現裂分，響應較高。當以甲醇-水（含0.2%甲酸）為流動相時，其峰形和響應與甲醇-水（含0.1%甲酸）相當，考慮到色譜柱對酸的耐受程度，實驗最終選擇甲醇-水（含0.1%甲酸）作為流動相。

表4 疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測定結果

3.2 稀釋溶劑的選擇 在供試品和對照品溶液制備過程中，發現終溶液如果所含甲醇比例較高，會因與流動相不匹配而產生強溶劑效應，導致色譜峰形的畸變；反之，如果采用純水稀釋系列溶液，則會因為內標在水中的溶解度低而析出形成渾濁液體。實驗考察比較了甲醇-水系統（水相不含，或含有0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸） 不同比例 5∶5、4∶6、3∶7 和2∶8作為稀釋劑時，次黃嘌呤和內標6-巰基嘌呤的峰形和響應，結果表明當以甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）為稀釋劑時，二者的響應最高且峰形良好。

3.3 離子源的選擇 考察了待測物在ESI和APCI兩種電離方式下的響應，發現采用APCI電離源，次黃嘌呤和6-巰基嘌呤的響應極其微弱，而采用ESI電離源二者的響應提高了幾個數量級，這可能與次黃嘌呤和6-巰基嘌呤均為極性化合物有關，更適合選用ESI電離源。

3.4 電離方式的選擇 將次黃嘌呤和6-巰基嘌呤對照品溶液經由蠕動泵連續進樣，比較正、負電離方式下化合物的響應，發現次黃嘌呤和6-巰基嘌呤在負離子模式下，均可產生響應較高且穩定的[MH]-離子。因此選擇在負離子模式下采用MRM掃描方式檢測。

3.5 實驗結果分析 本文建立的分析方法可方便、準確測定疏血通注射液中次黃嘌呤濃度，為其提供技術支持，較常規UV檢測方法可大大縮短分析時間。國家食品藥品監督管理局頒布的WS3-548（Z-084）-2005（Z）文件，要求疏血通注射液中含次黃嘌呤不得低于0.05 mg/mL，由表4可見，20個批次疏血通注射液中次黃嘌呤濃度穩定集中在0.117～0.138 mg/mL，即（0.129±0.005）mg/mL（n=20），表明產品質量合格、生產工藝穩定，次黃嘌呤可作為疏血通注射液質量分析、評價的指標成分。

4 結論

本文所建立的固相萃取LC-MS/MS方法簡便、準確、靈敏，可用于疏血通注射液中次黃嘌呤濃度測定。