同型半胱氨酸通過YAP 通路調控大鼠冠狀動脈血管平滑肌細胞高反應性的作用機制研究

陳玉龍，萬招飛，劉小軍，范佳麗，薛嘉虹，王新宏

冠狀動脈痙攣指冠狀動脈驟然強烈收縮引起血管閉塞或接近閉塞，導致心肌缺血，進而引發冠狀動脈痙攣型心絞痛、心肌梗死或猝死等嚴重心血管事件，目前其發病率較高［1］。冠狀動脈痙攣常突然發病，不易預測［2］，目前研究認為冠狀動脈血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）高反應性是其發生的關鍵［3］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸代謝過程中產生的含硫非必需氨基酸，高Hcy（血Hcy ≥15 μmol）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的獨立危險因素。既往研究表明，高Hcy 可作為冠狀動脈痙攣型心絞痛的生物學標志物之一［4］；另外，高Hcy 還能誘導小鼠冠狀動脈痙攣［5］。但Hcy 引發冠狀動脈痙攣的具體機制尚不清楚。YAP 是一種調控細胞增殖、分化及凋亡的轉錄共激活子，由YAP1 基因表達，是Hippo信號通路下游的主要效應子，因此其表達水平和功能受Hippo 信號通路調控。Hippo 信號通路被抑制，YAP 從胞質轉入胞核并結合轉錄增強子，促進基因轉錄，進而調控多種生物學功能［6］。既往研究表明，YAP 激活可導致肺動脈高壓［7］。但YAP 在冠狀動脈VSMC 高反應性中扮演何種角色及相關機制尚不明確。本研究旨在探討Hcy 通過YAP 通路調控大鼠冠狀動脈VSMC 高反應性的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018 年1—10 月，雄性SD 大鼠均購自西安交通大學實驗動物中心，體質量300～350 g，在清潔級動物房單籠飼養，自由攝食飲水，保持大鼠生活環境通風及清潔衛生，溫度為（24±1）℃，相對濕度為40%～60%，12 h 光照/黑暗交替。本次動物實驗步驟經西安交通大學醫學部倫理委員會審核批準。

1.2 主要儀器及試劑 DMT620 微血管張力測定儀（丹麥DMT 公司生產）、CO2細胞培養箱（美國Thermo公司生產）、電泳儀（美國Bio-Rad 公司生產）、ChemiDoc XRS 化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司生產）；DL-Hcy、內皮素1（ET-1）、內皮素B 型受體激動劑蛇毒類似物（sarafotoxin 6c，S6c）、YAP1抑制劑維替泊芬（verteporfin，VP）購自美國Sigma-Aldrich 公司；抗β-actin、內皮素A 型（ETA）受體、內 皮 素B 型（ETB） 受 體、YAP、ERK1/2、mTOR、AMPK、磷 酸 化ERK1/2（p-ERK1/2）、磷 酸 化mTOR（p-mTOR）、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體及抗Sirt1抗體均購自美國Abcam 公司或美國Cell Signaling 公司。

1.3 離體血管環制備及培養 對SD 大鼠實施安樂死后在無菌環境中迅速去除心臟，置于4 ℃標準鈉鹽緩沖液（NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaHCO315 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L）中，緩慢擠壓出心臟殘留血液。在體視顯微鏡下分離出間隔支、對角支和前降支，置于4 ℃標準鈉鹽緩沖液中，細金屬絲（40 μm）穿入血管腔去除內皮，剝離外膜組織，將血管橫切成長1.0～1.5 mm 的血管環。將新鮮的冠狀動脈血管環作為A 組；在37 ℃、5%CO2條件下，將在含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養基中培養的冠狀動脈血管環作為B 組，將在Hcy（200 μmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養基中培養的冠狀動脈血管環作為C 組，將在VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養基中培養的冠狀動脈血管環作為D組，將在Hcy（200 μmol/L）+VP（1 nmol/L）+含青霉素（100 U/L）和鏈霉素（100 μg/L）的DMEM 低糖培養基中培養的冠狀動脈血管環作為E 組；除A 組外冠狀動脈血管環均培養24 h。

1.4 血管收縮張力測定 在新鮮或培養24 h 的冠狀動脈血管環（去除內皮）內穿兩根微細鋼絲，其中一端連接myograph system 傳感器，另一端連接微調裝置，接入PowerLab 系統持續記錄血管收縮張力。每個血管環給予2 mN 的預張力后穩定1.0～1.5 h，期間每15 min 更換1 次恒溫（37 ℃）的標準鈉鹽緩沖液，血管環穩定后采用高鉀緩沖液（K＋60 mmol/L）檢驗血管收縮活性兩次并計算平均值，將平均值作為ETA受體或ETB受體激動劑收縮強度的參照標準，高鉀緩沖液引起的血管收縮張力＞1.0 mN 的血管環可用于正式實驗。S6c 使用前先采用標準鈉鹽緩沖液稀釋成濃度梯度，以濃度累加法將藥物由最低濃度依次加入浴槽，數秒內引起血管收縮，當收縮曲線達到最高不再繼續上升時即加入下一濃度的藥物，所測累積濃度-反應曲線即代表ETB受體誘導的血管收縮情況。待血管張力恢復基線后（提示ETB受體已完全消耗分解）以同樣的方法加入ET-1，所測累積濃度-反應曲線即代表ETA受體誘導的血管收縮情況。S6c 和ET-1 誘導的血管壓力變化以60 mmol/L K+誘導的血管收縮百分比表示。

1.5 Western blot法 采用Western blot法檢測ETA受體、ETB受體、YAP 及ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、Sirt1 表達水平，具體如下:采用細胞裂解液裂解離體培養血管環，4 ℃環境下12 000×g離心20 min，取上清液，嚴格按照Pierce BCA 蛋白定量試劑盒說明書操作步驟檢測蛋白表達，蛋白變性后SDS-PAGE 凝膠電泳后轉PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入適當濃度的一抗，將膜在4 ℃環境下孵育過夜，洗脫后加入適當濃度的二抗，置于37 ℃環境下孵育60 min，顯色后利用ChemiDoc XRS 化學發光成像系統采集圖像，Quality One 軟件分析目標條帶灰度值，并與內參β-actin 比較。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hcy 上調冠狀動脈VSMC 的ETA受體、ETB受體、YAP 表達及其受體介導的血管收縮 Hcy 可增強S6c 和ET-1呈濃度依賴方式介導的冠狀動脈血管收縮，見圖1。A、B、C 組冠狀動脈血管環的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較，差異有統計學意義（F 值分別為5.516、30.028、40.494，P 值分別為0.044、0.001、＜0.01）；C組冠狀動脈血管環的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin 高于A 組和B 組，B組冠狀動脈血管環的ETB受體/β-actin 及YAP/β-actin高于A 組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2～3）。2.2 VP 抑制由Hcy 上調冠狀動脈VSMC 的ETA受體、ETB受體、YAP 表達及其受體介導的血管收縮 VP 能有效抑制由Hcy 上調的S6c 和ET-1 呈濃度依賴方式介導的冠狀動脈血管收縮，見圖4。B、C、D、E 組大鼠冠狀動脈血管環ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin及YAP/β-actin 比較，差異有統計學意義（F 值分別為17.593、109.180、149.356，P 均＜0.01）；C 組大鼠冠狀動脈血管環ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin及YAP/β-actin 高于B、D、E 組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖5～6）。

圖1 A、B、C 組S6c、ET-1 誘導的冠狀動脈血管環收縮的累積濃度-反應曲線Figure 1 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups A，B and C

圖2 A、B、C 組冠狀動脈血管環ETA 受體、ETB 受體及YAP 電泳結果Figure 2 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups A，B and C

圖3 A、B、C 組冠狀動脈血管環ETA 受體/β-actin、ETB 受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較的條形圖Figure 3 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups A，B and C

2.3 Hcy 上調冠狀動脈VSMC p-ERK1/2和p-mTOR 表達 B、C、D、E 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比較，差異有統計學意義（F 值分別為37.903、15.229、24.202、46.071，P 均＜0.01）；C 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高 于B、D、E 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 組，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖7～8）。

3 討論

圖4 B、C、D、E組S6c、ET-1誘導的冠狀動脈血管環收縮的累積濃度-反應曲線Figure 4 Cumulative concentration-reaction curve for vasoconstriction of coronary artery mediated by S6c and ET-1 in groups B，C，D and E

圖5 B、C、D、E 組冠狀動脈血管環ETA 受體、ETB 受體及YAP 電泳結果Figure 5 Electrophoretic results of ETA receptor，ETB receptor and YAP of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

ET-1 是一種有效的血管收縮因子，能誘導血管持續且強烈地收縮，其與受體結合后可發揮生物學功能。 ET-1 的受體主要包括ETA受體和ETB受體，正常生理狀態下ETA受體表達于VSMC，可介導血管收縮；而ETB受體則表達于血管內皮細胞，可通過釋放一氧化氮和前列腺環素而介導血管舒張。病理狀態下，ETB受體僅表達于VSMC 且呈高表達狀態，介導血管強烈收縮，增強VSMC 對ET-1 的高反應性［8］。既往研究表明，心臟缺血再灌注能誘導冠狀動脈VSMC 高表達ETB受體［9］。另外，一些心血管危險因素如吸煙［10］、微氧化的低密度脂蛋白［11］和大氣細顆粒物（PM2.5）［12］等均能上調冠狀動脈VSMC 的ETA和ETB受體表達，進而增強血管平滑肌收縮的敏感性，提示冠狀動脈VSMC 高反應性在冠狀動脈痙攣過程中具有關鍵作用，而上調內皮素受體表達可能是冠狀動脈VSMC 高反應性的關鍵原因之一。本研究結果顯示，Hcy 可增強S6c 和ET-1 呈濃度依賴方式介導的冠狀動脈血管收縮，且C 組冠狀動脈血管環的ETA受體/β-actin、ETB受體/β-actin 高于A 組和B 組，B 組冠狀動脈血管環的ETB受體/β-actin高于A 組，提示Hcy 通過上調內皮素受體而增強冠狀動脈VSMC 高反應性。

圖6 B、C、D、E 組冠狀動脈血管環ETA 受體/β-actin、ETB 受體/β-actin 及YAP/β-actin 比較的條形圖Figure 6 Bar charts for comparison of ETA receptor/β-actin，ETB receptor/β-actin and YAP/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

圖7 B、C、D、E 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2、ERK1/2、p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK 及Shirt1 電泳結果Figure 7 Electrophoretic results of p-ERK1/2，ERK1/2，p-mTOR，mTOR，p-AMPK，AMPK and Shirt1 of coronary vascular ring in groups B，C，D and E

既往研究表明，YAP 是關鍵的血管生成調節因子［13-14］，其激活能促進肺動脈高壓發生［7］。但目前YAP 與冠狀動脈VSMC 高反應性的關系尚不清楚。本研究結果顯示，C 組冠狀動脈血管環的YAP/β-actin 高于A 組和B 組，B 組冠狀動脈血管環的YAP/β-actin高于A 組，提示Hcy 能上調冠狀動脈VSMC 的YAP 表達。為了進一步明確YAP 在Hcy 調控冠狀動脈VSMC內皮素受體中的作用，本研究通過阻斷YAP 而觀察Hcy 對大鼠冠狀動脈VSMC 內皮素受體表達及其受體血管收縮的影響，結果發現YAP 抑制劑VP 能有效抑制Hcy 上調的冠狀動脈VSMC 的ETA和ETB受體及其受體介導的血管收縮。前期研究發現，Hcy 或高糖可通過ERK1/2、Sirt1、AMPK、mTOR 信號通路介導調控VSMC內皮素受體［15-17］，那么YAP 能否通過以上通路影響Hcy 對冠狀動脈VSMC 內皮素受體的調控？本研究結果顯示，C 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR 高于B、D、E 組；B 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2高 于D 組，p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 高于C、D、E 組，提示YAP 抑制劑僅能抑制由Hcy 上調的ERK1/2、mTOR 磷酸化表達，但對Hcy 下調的AMPK磷酸化和Sirt1 表達無影響，提示ERK1/2和mTOR 信號通路可能參與YAP 對內皮素受體的調控。

綜上所述，Hcy 可能通過YAP 通路激活ERK1/2和mTOR 信號通路，上調VSMC 內皮素受體，進而增強冠狀動脈VSMC 高反應性，這將為高Hcy 致冠狀動脈痙攣的具體作用機制研究提供新的理論依據，也為高Hcy 所致缺血性心血管疾病的診斷和臨床研究提供新的線索。

作者貢獻：陳玉龍進行文章的構思與設計；萬招飛進行研究的實施與可行性分析；劉小軍進行數據收集、整理、分析；范佳麗進行結果分析與解釋；王新宏負責撰寫論文，對文章整體負責，監督管理；薛嘉虹進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。

圖8 B、C、D、E 組冠狀動脈血管環p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK 及Shirt1/β-actin 比較的條形圖Figure 8 Bar charts for comparison of p-ERK1/2/ERK1/2，p-mTOR/mTOR，p-AMPK/AMPK and Shirt1/β-actin of coronary vascular ring in groups B，C，D and E