氟比洛芬微生物計數方法適用性研究

北京市藥品檢驗所 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室（102206）江志杰 張光華

北京茗澤中和藥物研究有限公司（102629）李斐菲 郭青葦

氟比洛芬又稱苯氟布洛芬、氟聯苯丙酸，是一種強效苯丙酸類解熱抗炎鎮痛藥，能抑制前列腺素合成環氧合酶而起到止痛、抗炎及解熱作用。它為白色或類白色結晶性粉末，在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中易溶，在乙腈中溶解，在水中幾乎不溶[1]。它是一種新型的非甾體類鎮痛抗炎藥，品種有片劑、滴眼藥、緩釋膠囊劑等[2]。藥品一旦受到微生物污染，將造成藥品變質，主要成分分解而失效，也可能分解產生毒素，造成機體反應，引起疾病甚至威脅生命[3]，而原料的微生物污染情況直接影響到最終產品的質量。微生物檢查作為藥品安全性的重要指標[4]，微生物計數法用來測定原輔料或藥品受污染的程度，評價產品的一般衛生質量及安全性[5]。按照《中國藥典》2015年版四部通則1107非無菌藥品微生物限度標準的規定，應對產品進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。中國藥典2005年版開始引入微生物檢查方法驗證試驗，通過方法適用性試驗研究來考察其抑菌性的大小，制定適合產品的微生物學檢查方法[7]，以保證選用方法準確、可靠。本文按照《中國藥典》2015年版的操作要求及指導原則，對氟比洛芬微生物計數方法進行適用性研究，以確定適宜、有效的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備 SPX-100B-Z生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DNP-9082電熱恒溫培養箱（TAMATO科學株式會社）；XS1.DTXD-0.36脈動真空滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術公司）；JM-B2002電子天平(諸暨市超澤衡器設備有限公司)。

1.2 樣品 氟比洛芬（批號分別為2131701、2131702、2131703），由永光制藥有限公司生產。

1.3 試劑與培養基 蛋黃卵磷脂（批號：20180304）和組氨酸鹽酸鹽（批號：20180304）來源于北京奧博星生物技術有限責任公司；聚山梨酯80（批號：1306211）、磷酸氫二鉀（批號：1405061）和磷酸二氫鉀（批號：1303011）來源于西隴化工股份有限公司；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：20171208）來源于青島高科園海博生物技術有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：20170123）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：20170711）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：20170920）和胰酪大豆胨液體培養基(批號：20170810)來源于青島高科園海博生物技術有限公司，均在驗證合格的滅菌程序下滅菌，培養基適用性試驗均符合藥典要求。

pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液：照中國藥典2015年版通則8004配制，過濾，分裝，滅菌。

緩沖液A：聚山梨脂80 30g、蛋黃卵磷脂3g、組氨酸鹽酸鹽1g、蛋白胨1g、氯化鈉4.3g、磷酸二氫鉀3.6g、磷酸氫二鈉7.2g、純化水1000ml，121度消毒15分鐘。注意：先將蛋黃卵磷脂加到聚山梨酯80中，研磨，混合，然后加入培養基或是混合液體中，煮沸，待完全溶解后分裝，消完毒后，帶厚手套，將底下的沉淀慢慢搖均勻，也可以放置一周后，搖勻使用。

1.4 菌種 金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]、銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]、大腸埃希菌 [CMCC(B)44102]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]均購自中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代數均為第3代。

1.5 試驗環境 符合《中國藥典》2015年版的要求，在環境潔凈度D級下的局部潔凈度B級的單向流空氣區域內進行；微生物限度室、潔凈工作臺及生物安全柜潔凈度經監測符合相關要求；每次試驗潔凈工作臺沉降菌監測記錄均符合規定。

2 方法

2.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml胰酪胨大豆肉湯培養基中，33℃培養24h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至10ml沙氏葡萄糖液體培養基中，23℃培養24h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。

附表1 不同方法的預實驗結果

附表2 氟比洛芬微生物計數方法適用性回收比值

附表3 中和劑對照組的回收比值

接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中，25℃培養7d，加入3ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 微生物計數法用供試液的制備 供試液①：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

供試液②：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

供試液③：取本品5g，加緩沖液A至1000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

2.3.1 菌液對照組 方法1、方法2、方法4和5：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，加入制備好的試驗菌液0.1ml（細菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混勻，使每1ml稀釋液中含菌量小于100cfu，分別取此菌液1ml注皿，測定其每毫升的活菌數，結果為 A。方法3：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液20ml，加入制備好的試驗菌液0.1ml（細菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混勻，使每2ml稀釋液中含菌量小于100cfu，分別取此菌液2ml注皿，測定其每毫升的活菌數，結果為A。

2.3.2 供試品對照組 方法1、方法2、方法4和5：分別取取供試液①、供試液②、供試液③10ml，加入稀釋液0.1ml，取1ml注皿，分別測定供試品本底的需氧菌總數和霉菌和酵母菌總數，測定結果為B。方法3：取供試液③20ml，加入稀釋液0.1ml，取2ml注皿，分別測定供試品本底的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，測定結果為B。

2.3.3 試驗組 方法1、方法2、方法4和5：取供試液①、供試液②、供試液③10ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗菌菌懸液0.1ml，混勻，取1ml注皿，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，測定結果為C。方法3：取供試液③20ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗菌菌懸液0.1ml，混勻，取2ml注皿，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，測定結果為C。

2.3.4 中和劑對照組 方法5：取供試液③10ml各五只試管，分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗菌菌懸液0.1ml，混勻，取1ml注皿，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，測定結果為D。上述所加菌液的體積均未不超過供試液體積的1%。已注入供試液的平皿，細菌計數傾注胰酪胨大豆瓊脂培養基，而方法5是傾注含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂的胰酪胨大豆瓊脂培養基，待凝固后，置33℃培養3d，逐日觀察結果；霉菌和酵母菌計數傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，待凝固后，置25℃培養5d，逐日觀察結果。

2.3.5 比值計算 試驗菌的比值=(菌落數C-菌落數B)/菌落數A；中和劑對照組的比值=菌落數D/菌落數A。

3 結果與分析

3.1 微生物計數方法適用性預實驗結果 從附表1預實驗結果可以看出，方法1中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉的回收率均為0，說明氟比洛芬的抑菌作用很強，通過分析發現，供試液①pH值為6.0左右，偏酸性，因此后面的試驗均采用了堿性的磷酸緩沖液作為稀釋液，考慮到樣品為非水溶性的粉末狀，為了分散均勻，稀釋液中添加了一定量的聚山梨酯80；方法2中的銅綠假單胞菌的回收率為0.2，方法3中的金黃色葡萄球菌的回收率為0，可能是供試液量增加導致的，均不符合藥典要求；方法4結果顯示，除銅綠假單胞菌的回收比值為0.4，其余試驗菌株的回收比值均大于0.5，因此考慮在培養基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80。

3.2 微生物計數方法適用性結果 氟比洛芬的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數采用平皿法進行方法適用性試驗結果見附表2。在3次獨立的需氧菌計數方法平行試驗中，金黃色葡萄球菌的回收比值分別為1.1、0.9、0.7，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.6、1.0、0.8，銅綠假單胞菌的回收比值分別為1.0、1.0、0.9，黑曲霉的回收比值分別為0.8、1.0、0.9，白色念珠菌的回收比值分別為0.9、1.0、1.3，5株需氧菌的回收比值均符合藥典規定，因此，可照此方法測定氟比洛芬的需氧菌總數。在3次獨立的霉菌和酵母菌計數方法平行試驗中，黑曲霉的回收比值分別為0.7、0.9、0.8，白色念珠菌的回收比值分別為0.7、0.9、1.1，2株真菌的回收比值均符合藥典規定，因此，可照此方法測定氟比洛芬的霉菌和酵母菌總數。

3.3 中和劑對微生物有無毒性結果 為考察緩沖液A和培養基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80對微生物有無毒性，設置了中和劑對照組，從附表3中的結果來看，中和劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數比值均在0.8～1.5之間，符合藥典要求的0.5～2.0范圍內。

4 討論

隨著《中國藥典》2015年版的實施，對原料及輔料的微生物限度控制也越來越嚴格[6]。而原料的微生物檢驗方法適用性驗證也應符合《中國藥典》2015年版四部[7]通則1106的要求，若回收比值為0.5～2.0，方法可用于樣品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數檢查。產品存在抑菌性時，中國藥典2015年版強調的方法學適用性試驗更顯重要性，只有采用適宜方法去除抑菌活性，才有可能檢出藥品中污染的微生物，避免檢驗結果假陰性，從而保證微生物限度檢查方法的科學性，以有效控制藥品質量[8]。已有許多文獻報道，通過各種手段消除供試品的抑菌作用，找到合理的科學的檢測方法。平皿法是非無菌制劑微生物計數的傳統方法，具有簡單方便，成本低，結果準確的優點，是優先考慮的方法[4]。預實驗發現氟比洛芬的抑菌性比較強，而薄膜過濾法能直接徹底消除抑菌作用、計數結果準確度高，但是不適用于非完全溶解的供試品。Tween-80 和卵磷脂常作為季銨化合物、對羥基苯甲酸等化合物的中和劑，可能會保護微生物細胞膜起到中和作用。聚山梨酯80是一種表面活性劑，可作為乳化劑和中和劑等，用于藥品的微生物限度檢查時供試液的制備，使供試液分散系統更具相容性。因此，選用卵磷脂和聚山梨酯80作為中和劑，采用培養基稀釋法，最低稀釋級取1∶200的供試液1ml 注皿，才可以消除其抑菌作用。最終確定的方法為：取本品10g，加緩沖液A至2000ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶200的供試液。需氧菌總數測定，取1∶200的供試液1ml，注皿，平行2份，注入3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的胰酪大豆瓊脂培養基，依法檢查（中國藥典2015年版通則1105平皿法）；霉菌和酵母菌總數測定，取1∶200的供試液1ml，注皿，平行20份，依法檢查（中國藥典2015年版通則1105平皿法）。