人臍帶間充質干細胞尾靜脈注射移植對圍絕經期大鼠血清LH和INHB水平的影響

毛邱嫻，佘昊清，李嘉，尹春艷

(廣東省第二人民醫院,廣州510317)

近年來有研究發現，圍絕經期綜合征的發病年齡有年輕化趨勢，發病率也有所上升，成為影響中老年婦女生活質量的重要疾患之一。卵巢功能衰退是圍絕經期綜合征發生的重要原因，黃體生成素(LH)、抑制素B(INHB)是反映卵巢功能的重要性激素指標。近期研究發現，人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)移植對壓力性尿失禁、子宮內膜疾病、卵巢早衰等婦科疾病的治療有較好效果。2016年7～12月，我們將hUCMSCs移植入圍絕經期SD大鼠體內后，檢測移植前后大鼠血清LH、INHB水平變化，評估該細胞對圍絕經期卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 13～15月齡SD健康雌性大鼠40只，體質量410～450 g；3～6月齡SD健康雌性大鼠15只，體質量280～320 g；研究對象均由廣東省動物實驗中心提供，生產許可證號SCXK(粵)2009-0003,自然條件下喂養，食水自取。

1.2 實驗方法

1.2.1 hUCMSCs的傳代與擴增 hUCMSCs原代細胞購于重慶華雅干細胞技術有限公司，置于適宜的環境進行保存；對細胞進行沖洗、胰蛋白酶消化，用完全培養基進行消化終止。離心、去除上清后，用完全培養基重懸，以1∶3進行傳代；當細胞總數達到2×107個(細胞保證7代內)，將細胞配成1×106/mL的單細胞懸液備用。

1.2.2 圍絕經期大鼠的選取 40只13～15月齡SD大鼠編號后，于每日8:00行陰道周期涂片檢測，顯微鏡下觀察并記錄動情周期[1]。將出現動情周期紊亂或動情周期時間延長，如持續動情期、持續動情間期、無動情周期的大鼠納入圍絕經期[2，3]。

1.2.3 動物分組及hUCMSCs移植 將動情周期紊亂的30只大鼠隨機分為A、B組各15只，分別于尾靜脈注射移植液PBS、hUCMSCs(1×106/mL) 1 mL,隔日1次，共2次。15只3～6月齡(青年期)SD健康雌性大鼠(C組)作為對照，不予任何處理。

1.2.4 血清LH、IHNB檢測 在成模時(移植前)及移植后2、3、4周時，分別于各組大鼠眼眶內眥靜脈采血2 mL，放入4 ℃離心機(1 000 r/min×15 min)離心，將血清吸出移入EP管，-80 ℃冰箱保存備用；采用ELISA法檢測血清LH、INHB，操作流程按照說明書進行。

2 結果

2.1 各組血清LH水平比較 見表1。

表1 各組血清LH水平比較

注：與同組移植前比較，aP<0.05；與C組同時點比較，bP<0.05；與A組同時點比較，cP<0.05。

2.2 各組血清INHB水平比較 見表2。

表2 各組血清INHB水平比較

注：與同組移植前比較，aP<0.05；與C組同時點比較，bP<0.05；與A組同時點比較，cP<0.05。

3 討論

干細胞移植在現代臨床治療手段當中具有重要價值，對器官的衰老、不可逆損傷、難治性疾病有重要影響[4]。近幾年來，hUCMSCs因具有細胞易獲得，感染率、免疫原性低，培養方便，無倫理限制等優勢，在各治療手段當中備受關注。

間充質干細胞(MSCs)于1966年在骨髓中被發現，此細胞在特殊條件下可分化為肌腱、韌帶等細胞，其自我更新、增殖、多項分化潛能已得到認可[5]。hUCMSCs同樣具有定向分化潛能，且“可塑性”不亞于骨髓MSCs，同樣可定向分化為體內多種細胞[6]。在生物學特性上，hUCMSCs主要以貼壁生長為主，原代培養72 h后常呈成纖維細胞形態，胞質豐富，核大，3～4 d可進行傳代，傳代至20代后仍可維持細胞原有形態[7]。付霞霏等[8]將自身免疫性卵巢早衰小鼠移植hUCMSCs后，移植組早衰小鼠體內雌激素高于對照組、卵泡刺激素(FSH)低于對照組，鏡下卵巢組織也有所改善，認為hUCMSCs可有效改善早衰小鼠卵巢功能。在俞凌[9]的研究中，將hUCMSCs移植入雌性卵巢早衰小鼠體內，移植后小鼠卵巢內卵泡數目及質量均有效提高，細胞凋亡數目明顯減少。Sun等[10]建立了環磷酰胺誘導的卵巢早衰大鼠模型，移植hUCMSCs能增加激素分泌和卵泡發生，并減少卵巢細胞凋亡。這些研究表明hUCMSCs在卵巢早衰治療中有效，該結論也得到其他研究者的支持[11]。

卵巢周期性排卵的改變是女性生殖內分泌的特征。LH刺激體內雌激素分泌，促進卵泡成熟和排卵。臨床研究中，女性卵巢功能逐漸衰退，儲備功能下降，體內雌激素分泌量減少，導致LH水平升高；高水平LH可刺激卵泡分泌雌激素，使女性內分泌的激素變化有效循環。若雌激素仍處于低水平狀態，垂體負反饋減少，可進一步升高LH；隨著時間的推移，卵巢周期性激素變化失衡，卵泡發育逐漸抑制，最終進入絕經期[12]。

本實驗采用正常衰老大鼠作為模型，再現卵巢衰老狀態。結果發現,A、B組成模時圍絕經期大鼠血清LH水平均高于C組，A、B組間移植前差異無統計學意義，表明圍絕經期大鼠體內LH處于較高表達狀態。于移植后2、3、4周再次檢測LH，A組隨時間推移較移植前均有升高，表明A組卵巢功能進一步進入衰老；B組移植后2周血清LH水平低于A組，提示在hUCMSCs移植后2周就能改善卵巢分泌LH水平。胡佳佳等[13]研究發現，hUCMSCs移植圍絕經期大鼠2周后電鏡下卵巢結構改善，本研究結果與之相符，提示hUCMSCs可延緩圍絕經期大鼠卵巢衰老。移植后3、4周，B組血清LH水平仍低于同時點A組，表明hUCMSCs移植3、4周后仍有改善卵巢功能的效果。B組移植后2、3、4周仍高于同時點C組，表明hUCMSCs雖能有效緩解卵巢的衰老，但能否使其卵巢功能恢復到青年期大鼠水平，仍需進一步驗證。

近年來，INHB在臨床中對預測女性卵巢儲備功能有著越來越重要的位置。該蛋白對FSH有調節作用，在卵巢儲備功能減退時該蛋白能早于FSH發生變化。因此，有學者認為將血清INHB水平作為預測卵巢儲備功能的直接指標[14]。Zhang等[15]以卵巢早衰大鼠為研究對象，將hUCMSCs經靜脈注射或植入卵巢后第14、30天，大鼠卵巢內卵泡數目、激素水平有明顯提高。我們前期研究中發現，將自然衰老的圍絕經期大鼠體內移植hUCMSCs，第14天血清AMH、INHB水平較給予PBS大鼠升高，表明hUCMSCs可改善自然衰老的圍絕經期大鼠卵巢儲備功能[15]。本研究結果顯示，實驗成模時A、B組圍絕經期大鼠體內INHB激素水平均低于C組，兩組間差異無統計學意義；在移植后2、3、4周A組血清INHB水平較移植前降低，表明隨時間推移其卵巢功能逐漸衰老。而B組在移植后2、3、4周血清INHB水平均較移植前升高，且高于同時點A組水平。這提示hUCMSCs能有效改善大鼠卵巢功能，且持續至4周仍然有效，與胡佳佳等[13]研究結果相似。B組移植后2、3、4周血清INHB水平仍低于同時點C組，再次表明hUCMSCs雖能有效緩解卵巢的衰老，但未能使其卵巢功能恢復到青年期大鼠水平。有研究發現，將干細胞移植入化療導致的卵巢早衰小鼠體內，能使其恢復卵巢功能且完成生育。但是，hUCMSCs能否使圍絕經期大鼠恢復至青年時期水平，仍需更多實驗加以證明。

綜上所述，本研究發現，hUCMSCs移植入圍絕經期大鼠體內后，能有效降低LH水平、提高INHB水平，在移植后2～4周均有效果；而未移植大鼠隨時間推移，其卵巢功能逐漸走向衰老。因此，我們認為hUCMSCs移植可改善圍絕經期大鼠的卵巢功能，提高了其卵巢的貯備能力，雖不能使其卵巢功能達到青年期大鼠卵巢水平，但能有效延緩卵巢功能衰老。與青年期大鼠激素水平的差距是否與注射次數及注射劑量有關，仍需我們今后進一步加以驗證。