環境因子對中國檉柳遺傳變異的影響

孫麗坤，劉光琇，張寶貴，章高森

(1.甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070；2.中國科學院西北生態環境資源研究所，甘肅 蘭州 730000；3.太原師范學院，山西 晉中 030619)

任何一個物種的分布、行為、生理和遺傳變異都受到環境因子的作用[1]。遺傳多樣性是物種不斷適應生境的結果。當生境發生改變，例如氣溫驟降、氣候干旱化、土壤鹽堿化等，會使得種群的遺傳多樣性喪失[2]。反之，一個物種適應環境的能力也取決于種群內部遺傳變異的大小[3]。因此，在遺傳學和分子生態學領域，種群的遺傳變異與環境因子的相關性都是研究者關注的焦點[4-5]。目前，遺傳多樣性對環境因子的響應關系在云南松(Pinusyunnanensis)[6]、鈍桴野大麥(Hordeumspontaneum)[7]、巖生植物金發草(Pogonatherumpaniceum)[8]、小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)[9]、西番蓮屬(Passiflora)[10]等物種上被報道。

編碼核糖體的基因(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)是一個重要的植物分子標記片段[11]。nrDNA內轉錄間隔區(nuclear internal transcribed spacer，nrITS)常用于群體遺傳學研究[12-13]。被子植物的葉綠體DNA(chloroplast DNA, cpDNA)是母系遺傳，遺傳漂變使得單親遺傳的基因中累積的遺傳分化更大[11]。同時葉綠體DNA具有拷貝數多、分子量小、序列保守、設計通用引物方便、原核性和不參加基因重組等優點[14]，常用于研究植物的遺傳變異和物種進化歷史。

中國檉柳(Tamarixchinensis)隸屬于檉柳科(Tamaricaceae)，檉柳屬(Tamarix)。檉柳屬起源于早第三紀始新世的古地中海沿岸地區，并隨著晚第三紀古地中海的退縮、氣候逐漸干旱而得到進一步發展，產生了許多以溫帶成分為主、適應干旱、鹽堿環境的現代檉柳屬物種[15]。中國檉柳天然分布于華北、華東、華南、東北、西北的部分地區，耐鹽堿、貧瘠、水濕和干旱，適應性強，能夠在鹽堿地、沙荒地等極端環境中建群，且能通過鹽腺分泌鹽分和有害離子[16]，其生態價值顯著。

張娟等[17]利用RAPD技術(隨機擴增片段多態性DNA, random amplification polymorphic DNA)研究表明新疆境內剛毛檉柳(Tamarixhispid)群體間的遺傳分化為6.25%，群體內遺傳多樣性豐富。趙景奎[18]用RAPD技術研究發現黃河三角洲3個中國檉柳群體間存在頻繁地基因交流，92.83%的遺傳變異發生在群體內。推測與該植物種子能夠借助風、水等進行空間擴散有關。李銳[19]用EST-SSR(表達序列標簽-簡單重復序列, expressed sequence tags, simple sequence repeats)方法對6個中國檉柳群體的遺傳變異研究發現：Nei多樣性指數(h)平均為 0.456，香農(Shannon)多樣性指數(I)平均是1.776，群體間的變異僅占8.04%，進一步分析發現由于群體之間生境相似，受到的選擇壓力相近，其進化方向趨同，使得群體間的遺傳變異較小。Jiang等[20]利用SSR(簡單重復序列, simple sequence repeats)技術研究了黃河三角洲地區5個中國檉柳群體的遺傳變異，發現Nei多樣性指數(h)和Shannon 多樣性指數(I)分別是0.239、0.363，且群體間的遺傳變異小，表明群體間存在頻繁的基因交流。同時該研究還發現，土壤鹽度與遺傳多樣性呈顯著負相關。

中國檉柳分布范圍廣泛，枝葉繁茂，在鹽堿濕地、沙荒地具有綠化環境，改良生態的作用。然而，目前關于中國檉柳的研究多見于遺傳多樣性和遺傳結構方面，沒有針對遺傳變異與環境因素的響應研究。本研究采集了不同地理分布區域的中國檉柳群體，在分析其遺傳變異的基礎上，結合地理、氣候和土壤因素等多個生態子，探討了影響遺傳變異的主要環境因素，為更好地利用該物種進行生態改良和修復提供科學的實踐指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參照中國數字植物標本館(http://www.cvh.org.cn)、《中國植物志》、國內各個地方植物志和一些文獻中記載的中國檉柳分布區信息，本課題組于2014年7月開始在中國檉柳分布范圍內展開資源調查和樣品采集工作，對中國檉柳的現存分布區進行了野外調查，并采集了包括濱海濕地、黃河三角洲或沖積扇平原、沙荒地、鹽堿地、干旱地等生境的20個居群。這些居群分布在山東、江蘇、河南、山西、陜西及甘肅局部，記錄群體的海拔、經緯度、生境(土壤和地形條件)等信息(表1)。由于種群內部種子擴散或者是無性繁殖會對遺傳變異造成影響，在采樣時個體間間隔要求大于20 m，每個群體采集5～10個個體，采集新鮮幼嫩葉片，裝入信封后用硅膠干燥保存。

表1 中國檉柳各采樣點信息Table 1 Information about sampling localities of T. chinensis

1.2 實驗方法

1.2.1植物總 DNA 提取、目的片段擴增與測序 中國檉柳葉片DNA的提取采用 Omega 公司提供的植物DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit)，具體步驟按說明書進行操作。對4條葉綠體 DNA(cpDNA)片段篩選進行，最終確定2條cpDNA 片段(trnL-trnF,rps16)用于葉綠體遺傳多樣性分析。用于PCR擴增的引物及其文獻來源見表2。

表2 PCR篩選中使用的引物Table 2 Primer pairs used for PCR amplification and sequencing

擴增采用25 μL體系， 其中包括正反引物各1 μL(10 mmol·L-1)，DNA模板1 μL，12.5 μL的PCR mix(包括10X buffer, Mg2+, dNTP和Taq酶)，9.5 μL的去離子水。PCR擴增中相應片段退火溫度見表2，72 ℃延伸1 min 30 s。PCR擴增采用An S1000TM thermo cycler(Bio-Rad, CA, USA)。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選條帶單一無拖尾PCR產物進行純化并利用擴增引物(表2)進行測序，采用華諾科技ABI 3730 測序分析儀完成。

1.2.2氣候數據獲取 選取了中國檉柳20個研究點的年平均溫度(mean annual temperature, MAT)、年平均降水量(mean annual precipitation, MAP)、年最高溫(highest temperature, HT)、年最低溫(lowest temperature, LT)、夏季平均氣溫(summer mean temperature, SMT)和夏季平均降水量(summer mean precipitation, SMP)，冬季平均溫度(winter mean temperature, WMT)、冬季平均降水(winter mean precipation, WMP)。本研究還采用了干旱指數(aridity index, AI)分析了濕潤度對中國檉柳遺傳多樣性的影響[25]。氣象資料來源于2014年地面氣象資料(http://data.cma.cn/)。根據研究點從680個氣象臺站中選擇相應的臺站資料。

1.2.3土壤理化性質的測定 將土壤樣品風干，剔除石塊、植物根系等，磨碎過80目(0.18mm)篩，待分析檢測。土壤pH、土壤有機碳(soil organic carbon, SOC)，全氮(soil total nitrogen, STN)采用德國耶拿公司生產的碳氮分析儀Multi N/C 2100S (elementar Vario-EL，Germany)進行測定。土壤全磷(soil total phosphorus, STP)的測定采用鉬酸鹽/抗壞血酸-鉬藍比色法。

1.3 數據分析

利用 DnaSP Version 5.0 分別計算每個中國檉柳群體的ITS、cpDNA的核苷酸多樣性(nucleotide diversity, Pi)和單倍型多樣性(haplotype diversity, h)，其中插入缺失(indels)多態性未計算在內。在PAST軟件中，利用核苷酸多態性和單倍型多態性的結果，基于布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)方法對中國檉柳20個群體進行聚類。在SPSS 19.0軟件中，進行環境因子間的主成分分析，并用群體的遺傳多樣性與地理因子(經度、緯度及海拔)、氣候因子(MAT, SMAT, HT, LT, WMT, MAP, SMP, WMP, AI)和土壤因子(SOM, STN, STP, pH)之間進行皮爾森相關性分析，檢驗遺傳多樣性與環境因子間的關系。群體遺傳多樣性(Pi和Hd)與環境因子間的相互關系在CANOCO V4.5采用冗余分析(redundancy analysis，RDA)。考慮到群體間遺傳距離的差異可能導致遺傳分化，因此用DnaSP軟件計算群體間的遺傳分化FST，同時計算各居群采樣點間的直線地理距離矩陣，利用Mantel test通過在線軟件IBDWS 3.2.3(Available at http://ibdws.sdsu)計算遺傳距離和地理距離之間的相關性(r值)，運行 1000次重復抽樣檢驗顯著性。

2 結果與分析

2.1 中國檉柳的核苷酸多樣性和單倍型多樣性

在105個中國檉柳樣本的ITS 序列(616 bp)中，共發現了10個多態性位點，定義了11種單倍型。在135個中國檉柳trnL-trnF, rps16聯合序列(1542 bp)中，共發現了14個多態性位點，定義了16種單倍型。其中，中國檉柳ITS總核苷酸多樣性和總單倍型多樣性分別為2.170和0.814。葉綠體片段的總核苷酸多樣性和總單倍型多樣性分別為0.50和0.59(表3)。基于ITS和cpDNA的核苷酸多樣性和單倍型多樣性進行聚類分析，結果表明20個群體可以分為兩大支，甘肅白銀、蘭州和陜西定邊的一個群體聚為一支，其他17個群體聚為一支(圖1)。

2.2 中國檉柳遺傳距離與地理距離的相關性分析

基于母系單親遺傳的cpDNA序列和雙親遺傳的ITS序列，計算得出群體間的遺傳分化FST，同時得到各居群采樣點間的直線地理距離矩陣。結果表明ITS群體間的遺傳分化系數進行估算值為0～0.48，而cpDNA群體間分化系數估算值僅為0～0.17，有些甚至是負值，群體間遺傳分化小。通過Mantel test對群體進行距離隔離(isolation by distance，IBD)檢測，以便分析群體之間的遺傳距離與地理距離是否具有顯著相關性。ITS結果表明(圖2)，遺傳分化系數與地理距離存在顯著的正相關關系(r=0.399，P<0.001)，即隨著群體間分布距離的增大，遺傳距離顯著增大。但cpDNA遺傳分化系數與地理距離間沒有顯著的相關關系(r=0.103，P=0.17)。

表3 中國檉柳群體ITS和cpDNA單倍型分布及遺傳信息Table 3 Nucleotide diversity (Pi) and haplotype diversity (Hd) of ITS and cpDNA in 20 population of T. chinensis

2.3 中國檉柳遺傳多樣性與環境因子間的相關性分析

圖1 基于ITS和cpDNA核苷酸多樣性和單倍型多樣性的聚類分析Fig.1 Cluster analysis base on nucleotide and haplotype diversity of ITS and cpDNA

皮爾森相關分析結果表明：cpDNA的核苷酸多樣性和單倍型多樣性與各種環境因子間沒有顯著的相關性(表4)。ITS核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(h)均與經度極顯著正相關(P<0.001)，經度越大，遺傳多樣性越高。而兩者與海拔均極顯著負相關(P<0.001)。從氣候因素上看，溫度是影響ITS遺傳多樣性的重要因素，核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(h)與年平均氣溫、年最低溫、年最高溫、夏季和冬季平均氣溫都顯著正相關。而冬季平均降水僅與核苷酸多樣性(Pi)正相關。干旱指數對遺傳多樣性沒有顯著影響。土壤養分和pH對ITS遺傳多樣性均沒有顯著影響(表4)。為了對所有的環境因子進行降維和排序，利用冗余分析(RDA)發現海拔與ITS遺傳多樣性負相關，溫度與ITS遺傳多樣性正相關(圖3)。

圖2 基于ITS遺傳分化與群體地理距離的Mantel檢測Fig.2 Mantel tests for genetic isolation and geographic distance of ITS

由于以上16個環境因子間存在共線性，本研究進一步對它們進行主成分分析(表5)，結果表明，第一個主成分可解釋原始變量的 56.752%，從主成分的變量來看，主要為冬季平均溫度、經度和海拔(表6)；第二主成分解釋24.168%，主要為土壤有機碳、全年最高溫度和夏季平均溫度(表6)。前兩個主成分累計解釋變量達到80.920%(表5)。從以上結果可以發現，溫度、海拔和經度(海陸關系)是影響中國檉柳分布的最主要的環境因子。

表4 核苷酸多樣性和單倍型多樣性與環境因子的皮爾森相關分析Table 4 The pearson correlation analysis between nucleotide diversity, haplotype diversity and environmental variables

Note: Lat., Latitude; Long., Longtitude; Alt., Altitude; MAT, Mean annual temperature; LT, Lowest temperature; HT, Highest temperature; SMT, Summer mean temperature; WAT, Winter mean temperature; MAP, Mean annual precipation; SMP, Summer mean precipation; WMP, Winter mean precipation; AI, Aridity index; SOC, Soil organic carbon; STN, Soil total nitrogen; STP, Soil total phosphorous.

圖3 基于ITS核苷酸多樣性和單倍型多樣性與16個環境因子的冗余分析Fig.3 Bi-plot from the redundancy analysis (RDA) analysis based on Pi, Hd of ITS and 16 environmental variables

組分Component變異百分率Variationpercent累積百分率Cumulativepercent156.75256.752224.16880.92036.83087.75045.10092.85053.35896.20862.06498.272

表6 16個環境因子在前3個主成分軸上的載荷Table 6 The factor loadings of 16 environmental variables on the three principal components (PC) axes

3 討論

本研究分別以ITS和cpDNA片段作為分子標記，來檢測中國檉柳的群體遺傳多樣性及其與環境因子之間的相關性。結果揭示了該物種高水平的遺傳多樣性，得到中國檉柳ITS總核苷酸多樣性(HT)為0.803，高于一般針闊葉樹種0.206[18]，cpDNA總核苷酸多樣性(HT)為0.635，大于張如華[26]用cpSSR研究得到的東部10個中國檉柳HT(0.284)，具有較為豐富的遺傳多樣性，但種群間的遺傳分化較低，主要是由于中國檉柳具有較長的進化歷史，分布范圍廣，分布區內氣候、土壤等條件存在巨大差異，在長期自然選擇的作用下產生了廣泛的遺傳變異，種內具有豐富的遺傳多樣性。其中，ITS序列的分析結果顯示江蘇戧港的核苷酸多樣性最高，而山東河口的單倍型多樣性最高。cpDNA片段結果顯示陜西定邊(DB)核苷酸多樣性最高，而山西靈石的單倍型多樣性高。兩種分子標記所反映出來的各種群體遺傳多樣性水平不一致，此外，ITS序列的核苷酸多樣性也遠遠大于cpDNA的。

本研究表明ITS群體間的遺傳分化系數估算值為0～0.48，不同群體間差異較大，其中甘肅白銀群體、蘭州群體和陜西定邊(DG)群體與其他群體間FST為0.078～0.479，表明這3個群體與其他群體間的分化較為明顯。20個群體的聚類結果也說明了這一結論。依據距離隔離檢測，ITS遺傳距離具有顯著的地理漸變趨勢。表明地理距離是中國檉柳ITS遺傳變異分布產生的機制。而母系遺傳的cpDNA的遺傳分化沒有表現出顯著的地理格局。中國檉柳是兩性花，交配系統以異交為主的兼性自交，世代周期長，一年多次開花結種，繁殖能力強等特點可能是造成群體內遺傳多樣性較高的原因。且該植物群體間隔障礙少，種子和花粉能夠借助風、水等空間擴散導致基因流較大。在被子植物中，cpDNA是母系單親遺傳(種子)，而ITS是雙親遺傳(花粉和種子)。比較而言，ITS的總遺傳多樣性比cpDNA的大，這種差異一方面是由于ITS片段突變速率快，遺傳多樣性高，且更容易受到環境壓力的選擇，地理距離近的群體選擇壓力相近，進化的方向趨同，使得相近環境中的遺傳變異趨近；另一方面說明種子擴散對中國檉柳貢獻更大，使得cpDNA具有很大的基因流，實現不同居群之間的遺傳變異的均質化，因此沒有表現出明顯的地理分化。張如華[26]研究中國檉柳花粉-種子遷移率為7.1674，比中等遷移率(17)低一半還多，也說明歷史積累的種子流作用更大。

除考慮地理距離外，生態因子也可能影響群體間的分化。進一步分析中國檉柳遺傳變異環境因子間相關性發現，不同環境因子對中國檉柳遺傳多樣性的選擇壓力不同，溫度、海拔和經度(海陸關系)與ITS的遺傳多樣性顯著相關。分布在溫暖、低海拔和相對濕潤地區，如江蘇、山東的群體遺傳多樣性較高；分布在寒冷、高海拔和干燥地區，如甘肅、陜西的群體則反之。海拔、溫度梯度是影響許多物種多樣性的重要環節因子。研究發現，云南松在低緯度、低海拔、溫暖、降水量多的環境下遺傳多樣性豐富[6]，低海拔區域小葉錦雞兒群體的遺傳多樣性高于高海拔區域的群體，說明隨著海拔高度的增加，居群間的基因流受到阻礙[27]。我國北方油松(Pinustabulaeformis)的遺傳多樣性主要受溫度、海拔及年降水量的顯著影響[28]。本研究沒有發現土壤因子與遺傳多樣性的相關性。這與Jiang等[20]研究發現的中國檉柳的遺傳多樣性與土壤鹽度呈顯著負相關的結果不一致，可能與局域的采樣區和群體數目有關。綜上可以看出，中國檉柳在海岸灘涂地、濕地中遺傳多樣性高，群體更穩定，適應性更強，能很好地發揮生態恢復的功能。