色譜及其聯用技術在保健食品非法添加藥物檢測中的應用研究進展

項昭保,2,伍曉玲3,汪程遠,2,李承霖

(1.重慶工商大學環境與資源學院,重慶 400067;2.天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室,重慶 400067;3.重慶工商大學評估與督導辦公室,重慶 400067)

隨著社會經濟的不斷發展,人民生活質量不斷提高,“治未病”的大健康理念越來越深入人心。保健食品含有一定量的功效成分,能調節人體的機能,具有特定的功效,是人體機理調節劑、營養補充劑,有助于人體健康;同時保健食品屬于食品,食用安全?；诒＝∈称返墓δ苄院桶踩詢纱筇攸c,越來越多的人選購、食用保健食品,使得我國保健食品行業取得了快速發展。

但是保健食品不是藥品,它不以治療疾病為目的,僅僅具有調節機體功能,因此服用保健食品起效較慢,效果不明顯。在社會節奏越來越快的今天,人們越來越追求高效、快捷,對保健食品期望起效快、效果好。為滿足這種需求，增強保健食品的保健功能,一些利欲熏心的生產廠家往往在保健食品生產過程中違法添加化學藥物;一旦違法添加化學藥物以后,與市場上其他同類產品相比,短期內即可收到立竿見影的效果,從而迅速占領市場,因此保健食品非法添加化學藥物已成為當前保健食品造假的主要方式[1-2]。但是藥物進入食物,對食品安全性造成嚴重影響,對人民群眾生命安全造成了極大危害。

因此,保健食品非法添加化學藥物屬于食品藥品監管部門嚴厲打擊的對象。但是只有加強對保健食品中非法添加藥物的檢測,不斷規范和改進檢測技術,才能有效預防保健食品非法添加藥物的危害。對保健食品中非法添加藥物的檢測中,如何在成分復雜的保健食品中迅速發現非法添加藥物是關鍵。色譜技術是分離復雜混合物組分最有效的方法,在混合物分離純化中廣泛應用,配以合適的檢測手段,廣泛用于化學成分的定性定量分析。本文綜述了近年來色譜及其聯用技術在保健食品中非法添加藥物檢測中的應用,并進行了相應的歸納和分析,為保健食品中非法添加藥物檢測技術的進一步發展提供了參考,為保健食品生產銷售管理的進一步規范提供了依據。

1 薄層色譜法(TLC)及其聯用技術

1.1 薄層色譜法(TLC)

TLC操作簡單,無需復雜的儀器和設備,尤其對于基層藥品檢驗機構,可作為初篩保健食品中非法添加某些化學藥物的有效手段。李惠敏[3]用乙醇提取待測品,提取液用硅膠GF254薄層板展開,以乙酸乙酯-二氯甲烷-冰醋酸(25∶25∶0.2)為展開劑,建立了雙氯芬酸鈉、對乙酰氨基酚、吲哚美辛和萘普生等4種解熱鎮痛類的TLC定性分析方法,該方法操作簡單、分析速度快,同時具有良好的耐用性,并能同時分析多品種、多劑型、多規格的樣品,可滿足基層監管部門現場監管的需求。吳靜[4]分別取鎮靜安神類中成藥及保健食品一次服用量樣品經三氯甲烷提取后點于硅膠GF254薄層板上,以正己烷-氯仿-甲醇(5∶3∶1)為展開劑,地西泮,苯巴比妥和艾司唑侖三種化學成分能得到較好的分離。劉若冰等[5]采用TLC對10個市售減肥保健食品進行非法添加鹽酸西布曲明的定性鑒別,有8個檢出了鹽酸西布曲明,試驗方法簡便、快速,結果可靠。袁莉[6]采用TLC對11個潤腸通便類保健品中大黃予以鑒別,可快速、準確的判斷出潤腸通便類保健品中是否非法添加大黃。

TLC方法簡單、快速且重現性好,但定性能力有限,一般只能作為初篩手段,且易出現“假陽性”結果,而保健食品成分復雜,不同成分可能出現相同的比移值。因此,TLC必需有對照品且多次試驗才能確定待測樣品中是否含有非法添加的化學藥品,或者借助其他技術手段進一步確定。

1.2 薄層色譜法與紫外聯用技術(TLC-UV)

有些物質在紫外下會產生吸收光譜,利用物質分子紫外吸收所產生的紫外光譜及吸收程度可以對物質的含量和結構進行鑒定、分析。王藹英等[7]取相當于一次口服劑量的唐得康膠囊、糖舒寧膠囊、清脂降糖膠囊、天葛膠囊內容物,分別加入三氯甲烷超聲萃取,萃取液采用硅膠GF254薄層板,三氯甲烷-石油醚-甲醇-冰乙酸(8∶13∶1∶1)為展開劑,展開取薄層斑點,測其紫外吸收曲線,發現唐得康膠囊、糖舒寧膠囊、清脂降糖膠囊中非法添加了格列本脲,該方法簡便易行、專屬性較強,可用TLC-UV法對保健食品中摻入的化學降糖藥物進行快速檢測。余蘭等[8]采用TLC-UV法對15個市售減肥保健食品進行非法添加鹽酸西布曲明的定性鑒別,有8個檢出了鹽酸西布曲明,試驗方法簡便、快速,結果可靠。經TLC分離的樣品通過UV測試進一步定性分析,比單純的TLC定性能力強,但是物質的紫外吸收光譜基本上是其分子中生色團及助色團的特征,并非整個分子的特征。而且很多化合物在紫外沒有吸收或者只有微弱的吸收,因此利用UV鑒定有機化合物不如利用紅外光譜(IR)有效。

1.3 薄層色譜法與傅立葉變換紅外光譜聯用技術(TLC-FTIR)

紅外吸收峰的位置與強度反映了分子結構上的特點,可以用來鑒別未知物的結構組成或確定其化學基團,在未知化合物的結構鑒定上應用廣泛[9]。許鳳等[10]取10個減肥保健食品,用乙醇超聲提取,固定相為GF254鋁合金硅膠板,展開劑為乙酸乙酯∶石油醚(60～90 ℃)∶甲醇=10∶6∶1,分別用紫外燈(254 nm)和自制的2% NaOH試紙兩種檢視方法初篩,再利用TLC技術將可疑斑點分離純化后進行FTIR檢測,并與對照品的FTIR譜圖比較確認。所建立的方法準確、可靠,可作為該類產品是否添加酚酞的檢測方法。FTIR法對樣品純度要求較高,需要一套有效的分離技術。TLC法本身就是一種良好的分離技術,二者有效結合,對疑似含有非法添加化學藥品的保健食品進行初篩的基礎上,將目標化合物用TLC法分離制備后進行FTIR檢測,并與對照品的紅外光譜圖進行比較,利用FTIR的定性、檢索功能,能夠快速準確地判斷出保健品中是否含有非法添加化學藥品。對于非法添加的化學藥物成分明確的保健食品檢測,TLC-FTIR聯用技術有良好的應用。

FTIR加一個顯微鏡就可進行顯微紅外光譜分析(Micro-FTIR),其特點為靈敏度高,可以實現痕量樣品的分析;不需要添加任何稀釋劑,能反映樣品的本質光譜;官能團的空間分布,Micro-FTIR能夠給出吸收峰的圖像,根據特征吸收峰在樣品中的分布,判斷官能團的空間分布,有利于結構分析。許鳳等[11]取9個減肥保健食品,用甲醇超聲提取,以硅膠GF254鋁合金薄層板為固定相,以三氧甲烷-甲醇-氨水(11∶1∶0.12)為展開劑,用TLC快速初篩后,再聯用Micro-FTIR對其進行定性檢測。在檢查下的9批供試品中有2批含有鹽酸芬氟拉明,方法專屬性強、靈敏度高、重現性好,可以作為該類保健食品非法添加鹽酸芬氟拉明的快速檢測方法。但是化合物有些基團振動時偶極矩沒有變化,不出現紅外吸收峰,無法據此進行結構鑒別。

1.4 薄層色譜法與拉曼光譜聯用技術(TLC-Raman)

紅外光譜和拉曼光譜都屬于分子振動光譜,都是研究分子結構的有力手段,但紅外光譜和拉曼光譜的選律不相同,有些基團振動時偶極矩變化非常大,紅外吸收峰很強,是紅外活性;有些基團振動時偶極矩沒有變化,不出現紅外吸收峰,屬紅外非活性,這種偶極矩沒有變化的振動拉曼峰會非常強,屬于拉曼活性。因此,IR和Roman總體上互補,拉曼活性振動,適合用拉曼光譜進行結構分析。李想等[12]建立TLC-Raman聯用方法,并對減肥類保健食品中非法添加的四種化學成分(茶堿、咖啡因、苯丙酸諾龍、螺內酯)進行檢測。采用TLC法將摻雜成分與保健食品基質進行初步分離,在紫外燈下檢視定位,以780 nm激光為光源,對TLC上微量摻雜成分的斑點原位,直接檢測濃集點的拉曼光譜?？疾觳煌浞奖＝∈称坊|對摻雜成分拉曼光譜的影響,并對檢測限進行驗證,初步建立了減肥類保健食品中四種摻雜成分的TLC-Roman檢測方法。而且常用保健食品基質對摻雜成分檢測結果無干擾,不需要刮板。該法專屬、靈敏、快速、簡便,可為保健食品中非法添加化學成分的快速檢測技術研究提供新的參考依據。

基于TLC-Raman聯用技術,許鳳等[13]對降壓類保健食品中非法添加的3種化學成分(尼莫地乎、拉西地平和尼群地平)進行原位富集檢測,并對6種降壓保健食品進行了測試,TLC法采用硅膠60F254鋁合金薄層板為固定相,環己烷-乙酸乙酯(體積比5∶4)混合溶液為展開劑,在紫外燈下檢視定位,使添加成分與保健食品基質進行初步分離;再對薄層板上微量添加成分斑點用丙酮原位富集,直接檢測富集斑點的顯微拉曼光譜,結果表明,常用降壓類保健食品基質對添加成分檢測結果無干擾,顯微拉曼光譜技術更易于直接獲得大量有價值信息,共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規拉曼光譜的特點,還有自己的獨特優勢,具有微觀、原位、多相態、穩定性好、空間分辨率高等特點。該法準確、靈敏、簡便、快速,為保健食品中非法添加化學成分的快速檢測提供了新的手段,是TLC-FTIR檢測技術的有效補充,而且因為Raman光譜出現晚,更有新意。

2 氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)

氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)被廣泛應用于復雜組分的分離與鑒定,其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度,是復雜樣品組分定性定量分析的有效工具。李濤等[14]采用溶劑超聲或液-液萃取方式對樣品進行提取富集,采用GC-MS檢測降壓類中成藥及保健食品中非法添加化學藥物,在30～60 min內快速檢測降壓類中成藥及保健食品中是否非法添加尼群地平等7種化學藥物,并在2批樣品中分別檢出了尼群地平和可樂定,該法快速、準確,專屬性強,可用于快速打假中的檢測。肖麗和等[15]用甲醇提取樣品,采用全掃描一級質譜,并結合譜庫檢索進行定性鑒別;采用二級選擇反應檢測(MRM)方式進行定量分析,建立了鎮靜安神類中成藥及保健食品中非法添加艾司唑侖的GC-MS/MS檢測方法,該方法快速、靈敏、準確,可用于中成藥及保健食品中非法添加艾司唑侖的檢測方法。

GC-MS聯用分析的靈敏度高,有強大的數據庫檢索功能,方便對可疑色譜峰的初步判斷。雖然標準質譜庫有助于定性,但也并非完全可靠;在初篩陽性后,需要使用對照品或其他方式輔助定性。此外GC-MS對部分藥物的分析需要進行衍生化,耗時較長。因此GC-MS主要適用于低分子化合物(分子量<1000)分析,尤其適合于揮發性成分的分析。很多大分子或難氣化的化學藥物難以進行GC-MS分析。

3 高效液相色譜(HPLC)及其聯用技術

3.1 高效液相色譜(HPLC)

由高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜就出現的HPLC技術,具有高壓、高速、高效、高靈敏度和應用范圍廣的特點[16],特別是近年來采用了二極管陣列檢測器(DAD),提高了識別添加化學成分的科學性與準確性。邢俊波等[17]采用梯度洗脫,建立了同時分析測定補腎壯陽類中成藥及保健食品中非法添加7種西藥成分(豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、他達那非、氨基他達那非)的高效液相色譜法。該方法簡便快速準確,重復性好,適用于基層藥檢機構,可作為補腎壯陽類中成藥及保健食品中非法添加上述7種西藥成分的快速篩查方法。韓東岐等[18]采用梯度洗脫,建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測技術(HPLC-DAD)同時檢測鎮靜安神類中成藥及保健食品中非法添加的9種安眠藥物。顏偉華等[19]采用梯度洗脫,HPLC-DAD技術,建立抗疲勞類保健食品中那紅地那非、紅地那非、伐地那非等12種化藥成分的液相快速篩查方法。鄧鳴等[20]采用等度洗脫,建立了在同一色譜系統檢測中成藥及保健食品中非法添加9種調血脂類藥物成分的高效液相色譜快速檢驗方法。羅達龍等[21]建立了對3種不同劑型的保健食品樣品中17 種非法添加化學物的同時分析高效液相色譜法。

3.2 高效液相色譜與固相萃取聯用技術(HPLC-SPE)

色譜技術是分離純化手段,樣品成分越簡單,色譜分析越容易。因此若配以良好的預處理技術,后期的分析檢測簡單高效。固相萃取(Solid-Phase Extraction,簡稱SPE)是近年發展起來一種樣品預處理技術,由液固萃取和液相色譜技術相結合發展而來,主要用于樣品的分離、純化和濃縮,與傳統的液液萃取法相比可以提高分析物的回收率,更有效的將分析物與干擾組分分離,簡化樣品預處理過程,是復雜樣品進行儀器分析最廣泛應用的前處理技術[22]。多壁碳納米管分散型固相萃取(MWCNTs-dSPE)[23]與傳統固相萃取SPE相比,分散型固相萃取(dSPE)無需填充柱子和嚴格控制上樣及洗脫過程,直接將吸附材料加入含有目標分析對象的樣品提取液中,在雜質吸附模式下,吸附材料保留樣品中的雜質,從而實現樣品基質的凈化[24]。黃佳佳等[25]建立MWCNTs-dSPE-HPLC法測定降糖類保健食品中非法添加物羅格列酮的檢測方法。該樣品前處理方法簡便、快速且成本較低,適用于批量保健食品中羅格列酮的快速檢測。

表1 保健食品中非法添加HPLC-MS檢測方法Table 1 HPLC-MS methods for the determination of illegal addition in health food

HPLC法簡便、快速、準確、重復性好,適用于基層藥檢機構檢測非法添加藥物,但需要對照品,由于保健食品非法添加化學藥物的不確定性,同時又缺少廣譜篩查方法,尚難以定性與篩查未知藥物,檢測保健食品非法添加化學藥物任重道遠。

3.3 高效液相-質譜聯用技術(HPLC-MS)

HPLC技術具有高壓、高速、高效、高靈敏度和應用范圍廣的特點,但需要對照品才能定性,進而進一步定量分析。保健食品中非法添加的化學成分一般未知,生產企業也會選擇尚未被監測的化學成分添加。因此HPLC技術對保健食品復雜的化學成分高效分離后,尚需與能確定化學成分化學結構的技術聯用,才能對非法添加的未知成分進行快速定性定量分析。MS技術是目前單獨確定化合物結構的有效方法,HPLC-MS聯用技術既能對復雜成分進行快速分離,也能對具體成分進行結構分析,所以被越來越多地用于保健食品中非法添加化學藥物的檢測分析[26],表1作小結如下。MS分析的離子源一般都是ESI,質量分析器主要是三重四級桿和離子肼。色譜分離條件依保健食品具體成分而定,以梯度洗脫方式居多。

4 超高效液相色譜(UPLC)及其聯用技術

HPLC技術雖具有高速、高效、高靈敏度的特點,但保健食品成分很復雜,色譜分析時長一般均在40 min以上,有些色譜分析甚至超過60 min,耗時長。而超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)借助于高效液相色譜法的理論和原理,涵蓋了小顆粒填料、小系統體積(死體積)及快速檢測手段等全新技術[35-36],具有超高分離度、超高速度、超高柱效、高靈敏度等優勢,與傳統的HPLC相比,UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9、3、1.7倍,目前在分析實驗室中的運用越來越普及,在保健品中非法添加化學藥物檢測的應用越來越廣泛[37]。

4.1 超高效液相色譜(UPLC)

程燕等[38]采用梯度洗脫,建立了超高效液相色譜同時測定功能性飲品和抗疲勞類保健食品中非法添加的11種化學藥物。該法具有較好的專屬性、線性、回收率和精密度,在10 min內可實現11種化學藥物的分離,適用于抗疲勞類保健食品中非法添加的11種化學藥物的同時快速測定。王靜文等[39]采用梯度洗脫,建立了超高效液相色譜同時測定減肥類保健食品中非法添加的25種藥物的方法。該法在26 min內可實現25種化學藥物的分離,與傳統液相色譜方法相比,可在保證分離度的情況下,實現快速有效的高通量分析,且檢測的化合物種類較全面,可為監測保健食品非法添加藥物提供強有力的技術支持。

4.2 超高效液相色譜-質譜聯用技術(UPLC-MS)

UPLC與傳統的HPLC相比,分離速度、靈敏度及分離度均有明顯增加[47-48]。但需要新增設備及配套的實驗場地,所需成本較高。實心核顆粒色譜技術是近幾年開發的色譜填充新技術,該技術優化了高效液相色譜儀運行背壓,通過提高分離度以及峰容量實現了普通高效液相色譜儀分離效率的最大化,使得分析效率能媲美超高效液相色譜,而且通用性和普及性更強。勵炯等[49]以高色譜性能的實心核顆粒色譜柱,建立了降糖類保健食品中非法添加13種化學成分的定性定量檢測方法,簡捷快速(只需10 min即可完成檢測),靈敏度高,抗干擾能力強,可滿足實際樣品檢測的需要,特別涉及需要盡快報告結果的檢測時,效果很好。

5 色譜與其他技術三種聯用

為進一步確保結果的準確性,也有綜合了色譜技術與其他技術共3種技術聯用,用于保健食品中非法添加化學成分的檢測,如田國賀等[50]運用近紅外光譜(NIR)法對降糖類中藥及保健食品中非法添加鹽酸二甲雙胍進行快速篩選,采用逆向思維方法,以鹽酸二甲雙胍對照品NIR圖譜作為參照光譜,與降糖藥NIR光譜比對,建立對照品與中藥制劑及保健食品的相關系數,快速篩查中成藥及保健食品中是否非法添加了鹽酸二甲雙胍,經HPLC-MS聯用定性后,將法定檢驗結果與NIR結合,建立 NIR檢驗模型,建立的應急模型具有方法簡單、快速、易操作等特點,適用于大量樣品的快速篩選。廖春玲等[51]優化梯度洗脫條件,UPLC在12 min后便可分離18種藥物,并均保持良好峰形。提取樣品后先用UPLC將樣品中可疑色譜峰篩查出來,再用 GC-MS法進行確證,時間約為23 min,采用UPLC 和GC-MS法聯合檢測安神類保健食品新型非法添加藥物,操作簡單、快速且可靠。Zhang等[52]利用SPE技術進行前處理,建立了SPE-UPLC-MS方法檢測了廣東涼茶中非法添加阿司匹林、對乙酰氨基酚、氯曲美酮、雙氯芬酸、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢唑啉和齊特霉素等8個化學藥物,在36份廣東涼茶樣品中發現在4份樣本中非法添加對乙酰氨基酚、氯曲美酮和阿司匹林3種化學藥品,該方法具有良好的線性關系、選擇性、準確性、日內精度和日間精度。

6 結論與展望

近年來,保健食品非法添加化學藥物現象已受到廣泛重視,非法添加檢測技術研究和應用取得了一定的進展,國家食品藥品監督管理總局先后陸續批復了多個保健食品非法添加化學藥品檢測檢驗方法,如保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測(BJS 201710)。保健食品中違法添加化學藥物的檢測方向正向便捷、快速、高選擇性等方向發展,集高效分離技術和檢測技術于一體的聯用技術,如HPLC-MS技術越來越常用,但由于保健食品成分非常復雜,同時非法添加具有很大的不確定性,又缺少廣譜篩查方法,對其非法添加化學藥物的檢測還存在一些問題:

第一,檢測方法的針對性與化學藥物添加的隨意性難以協調?，F有國家食品藥品監督管理總局批復的保健食品非法添加化學藥品檢測方法,大多是根據少數在監管標準內添加的藥物建立,而對于未知添加藥物無法篩查;基層檢測單位僅僅根據相應方法對待測保健食品中某些特定的添加藥物進行篩查,做出是否添加相應藥物的結論,并不能對保健食品的安全性做出全面系統的判定,事實上不少經基層食品檢驗單位鑒定合格的保健食品,仍然含有其他有害身體健康的化學藥物未被檢測出。

第二,廣譜篩查方法的缺失?，F有檢測方法主要是基于目標篩查的模式建立,只能針對具體已知的非法添加藥物進行針對性評估,對于未知物質的篩查、定性定量分析則無能為力。很多不法廠商正是利用這一漏洞,非法添加現行檢測方法檢測目標物之外的相關藥物,謀取暴利,短期內非法添加的藥物卻不會被檢測,自然不會被查出。因此,檢測食品非法添加藥物任重道遠,未來需加大研發力度,在技術上開發與研究廣譜篩查方法,保障消費者的權益。

第三,加快制定檢測技術標準和推廣力度。當前對非法添加藥物的檢測技術研究越來越多,但能上升為技術標準,并推廣應用的少之又少。監管部門組織相關科研機構加快制定有效、廣譜的檢測技術標準,并盡快推廣應用,重點應集中在具有智能性、預警性和及時性等特點的技術標準,同時加快建設非法添加藥物陽性數據庫、數據源,并加快實現這些數據庫、數據源在全國范圍內的共享?？梢越梃b相關經驗[53-55],嘗試建立政府、企業之外的第三方認證平臺,監測保健食品的品質。

總之,保健食品非法添加化學藥物檢測技術研究越來越多,色譜法具有良好的分離能力,結合相應的檢識方法,理論上均能對非法添加藥物進行檢測。當前的重點是盡快建立便捷、快速、高通量的檢測方法,并形成相應的技術標準,適合在基層食品檢驗單位推廣應用,有效控制保健品質量，打擊保健品行業非法添加行為，保障消費者的權益。