銅綠假單胞菌檢測方法研究進展

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(1.武漢食品化妝品檢驗所,湖北武漢 430014;2.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA),假單胞菌屬,對營養條件要求較低,且易在潮濕環境中存活,因而在自然界中分布很廣泛,不論土壤還是水環境都能檢測到,甚至在人體的皮膚、呼吸道以及消化道等部位都有定植。在蔡雙福等[1]的調查中發現,在食品領域,涼拌菜、熟肉制品、飲用水等產品經常存在被PA污染的狀況。此外,由于PA能產生多種致病因子,很容易引起免疫力低下的病人感染。在治療過程中若不合理地使用抗生素,還會引發PA耐藥性問題,因此PA引起的感染以及其耐藥性都會給人類健康帶來很大的潛在危害,如何有效檢測耐藥性PA也成為醫學界重點關注的問題[2]。

GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》[3]和GB 19298-2014《包裝飲用水》[4]都明確要求PA不得檢出,最新版《化妝品安全技術規范》(2015年)[5]也要求化妝品中的PA不得檢出。然而多個學者研究表明,在PA的檢驗過程中存在一些問題,比如漏檢[6]、傳統培養法檢驗效率不高[7]等問題,因此PA的有效檢測問題也越來越受到學者的關注。

在微生物檢測領域,分子檢驗技術日趨成熟,以蛋白分析為基礎的免疫法、質譜、光譜等大型儀器分析方法,隨著信息技術、光電技術和儀器制造業的發展,在實現自動化微生物鑒定中的優勢逐漸顯現。由于PA自身的其基因組龐大,能依據環境的變化精密調節各種毒力因子的合成[8],因此無論是以鑒定特定基因為基礎的檢驗技術,或是以識別特異性蛋白為基礎的檢驗技術,在分離鑒定PA的過程中都存在一定的局限性。近些年學者們仍在不斷嘗試,以期實現迅速并準確地分析各類樣品中的PA污染狀況。本文將從傳統檢測方法，以核酸、蛋白質、全細胞為研究對象的檢驗方法，對近幾年PA的檢測方法的發展進行綜述。

1 傳統培養法

鑒定特定微生物的傳統方法一般是先觀察微生物的形態學特征,再輔以生理生化確認實驗進行判斷菌種類型。傳統培養法雖然實驗周期長,但因其實用性、可靠性強,依然是不可忽視的檢測方法[9]。許潘健等[10]從分析PA的代謝產物入手,將紅棗、黨參、枸杞子等中藥加入營養瓊脂以觀察對PA綠膿素產生的影響,結果表明與金氏B培養基相比,中藥瓊脂更能有效地促進PA綠膿素的產生,從而使傳統培養檢驗PA方法的效率有了進一步提升。Akoglu等[11]在十六烷三甲基溴化銨培養基中加入苯扎溴銨,改良后的培養基應用于乳制品的檢測,發現苯扎溴銨對熒光假單胞具有良好的抑制作用,有效地提高了原培養基對PA的選擇性。Weiser等[12]評價了四種培養基(乙酰胺瓊脂、假單胞CN培養基、假單胞分離培養基、顯色培養基)對PA的分離效果,結果表明,乙酰胺瓊脂選擇性較差,而顯色培養基選擇性最高可達70%,靈敏度可達到95%。高飛等[13]利用PA產生一種特殊酶來水解Pseudalert試劑中熒光底物,并依據酶在水解底物的同時產生的熒光變化來判斷樣本中是否存在PA。在實驗過程中采用含Pseudalert試劑的生理鹽水稀釋樣本,加入97孔無菌定量盤內在(36±1) ℃培養箱中培養24 h,對有黃色反應且有藍色熒光的樣本,通過查相關MPN表對PA進行定量,將該方法用于化妝品中可在24 h內即可得到結果,無需進行驗證試驗。Sartory等[14]也評價了基于Pseudalert試劑的MPN法與濾膜法定量檢測方面的差異,結果同樣顯示Pseudalert-MPN法在檢測泳池水樣中的PA時表現出較好的時效性。

傳統培養法對實驗條件要求不高,同時可以直觀地觀察結果,很適合基層實驗室開展實驗,但PA檢測中亟待解決的問題仍然是培養時間長,且在同一種培養基上PA的菌落形態也呈多樣性,需要確認實驗進一步證實結果[7]。目前市面的選擇性培養基特異性仍然有待提高,尤其是不能避免其他革蘭氏陰性菌的生長,選擇更具特異性的生化特征作為PA分離標準,以區別樣品中其他類似菌如熒光假單胞、惡臭假單胞菌,依舊是未來培養法研究的主要方向。

2 以核酸為分析目標的檢測方法

隨著檢測技術的不斷發展,分子生物學技術憑借強特異性、高靈敏度、簡便省時等特點,已經被廣泛應用在PA的檢測中,甚至針對PA基因組的測序工作也已經完成[15],但全基因測序方法在日常檢驗工作中仍過于繁瑣,目前常用的分子生物學檢驗方法主要有以下幾類:以聚合酶鏈式反應技術為基礎的單一PCR、多重PCR、定量PCR技術、環介導等溫擴增技術、基因芯片技術和新興的核酸生物傳感器技術[16]。

2.1 PCR技術

從普通PCR、單一定量PCR、多重定量PCR到熒光定量PCR,這一類的檢驗技術都已經應用在PA的檢驗中。由于PCR法對DNA片段濃度有一定要求,為了提高檢測靈敏度,很多研究者在預處理過程中采用預增菌[17]、磁珠富集、巢式PCR方法來獲得較高濃度的目標DNA片段[18]。此外普通PCR法不能區分死菌與活菌,導致實驗結果顯示假陽性[19],在發現疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA)和疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)能與死細菌基因組DNA結合后,已經有學者建立了EMA-PCR[20]或PMA-PCR方法[21],并將該方法應用到樣品中PA活菌的檢測中。為了進一步提高檢驗靈敏度和特異性,在普通PCR反應體系中加入熒光基團或染料,通過擴增過程中熒光信號的累積來反映體系中模板濃度變化的熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)檢測法發展起來。基于熒光定量PA檢測方法也已經有很多學者進行了嘗試[22]。依據實驗目的的不同,qPCR又可以分為單重定量和多重定量法。在利用多重定量PCR檢測PA主要有兩個研究方向,一種是在同一反應體系中針對包括PA在內多種微生物的目的基因進行擴增,可以同時完成幾種微生物的檢驗[23];另一種是在一個體系內對PA的多個目的基因進行擴增[24],以提供更準確的檢測信息。與常規的核酸擴增法相比,環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術利用4個引物識別靶基因6個區域,能在恒溫條件下快速完成核酸擴增,因此是一種靈敏度更好、效率更高、結果判定更簡單而且經濟有效的檢驗方法[25]。表1列舉了近幾年應用分子生物方法檢驗PA不同靶點的部分實例。

由表1可以看出,憑借高靈敏度、便攜性好、檢驗條件要求低等特點,LAMP技術成為繼PCR技術后近些年受研究人員青睞的PA檢測方法之一。總體來說,以核酸聚合酶鏈式反應為基礎的檢測方法能夠達到快速、靈敏、高精確度的檢測,但反應難以控制因DNA污染出現的假陽性和樣品中其他物質干擾出現的假陰性。

2.2 高通量核酸分析技術

近些年發展的基因芯片技術,通過集成定量PCR同一反應體系,實現了同時對PA的多個目的基因進行擴增,又可以同時針對包括PA在內的不同微生物的目的基因擴增,在檢驗效率及PA陽性檢出率方面有了進一步的提高。董進浪等[31]以酶顯色技術為基礎,根據細菌16S rRNA基因特點,構建了能同時針對包括PA在內的8種細菌性肺炎常見的病原菌進行檢驗的基因芯片,這種基因芯片法檢測速度快、準確性高、通量高,還具有特別的診斷價值,但制作過程較繁瑣復雜,成本偏高。

表1 不同靶點檢測PA應用實例Table 1 Application of different target gene used for detection of Pseudomonas aeruginosa

最近發展起來的高通量測序技術使得微生物檢驗能夠以更高的速度進行大規模的平行分析,并進一步帶動了檢測技術的發展。美國FDA發布的“全基因組測序技術(WGS)應用問答”更有助于研究人員在疾病暴發時可以更快地鑒定致病微生物,明確致病菌的毒力因子,確認疫情的源頭,起到預防食源性疾病暴發的作用。在防治PA引發的感染方面,Witney等[32]通過對英國兩家醫院中引起泛耐藥性PA進行的全基因組測序分析,不但確定了該菌株的耐藥基因、毒力因子,并且發現該菌株的基因組與近期感染者、水槽及下水道中菌株具有高度相似的序列,從而得出該菌株已經在醫院中流行多年的結論。

2.3 DNA生物傳感技術

隨著人們對低成本高精度檢測器的進一步追求,利用DNA為感應元件,通過將DNA與其他元器件相互作用的生物信號轉換成物理信號的生物傳感器也在PA的檢測中廣泛應用起來。Amini等[33]以ETA基因為靶基因,設計出一種以DNA條形碼技術為基礎的檢測PA的熒光生物傳感器。該傳感器以納米金粒子(GNPS)連接特異性識別ETA基因的探針和條碼DNA,納米磁性粒子(MNPs)連接特異性捕獲探針識別ETA基因另一部分序列。將兩種納米粒子與ETA基因混合后,ETA基因與MNPs復合物(MNPs-2ndDNA探針-ETA基因)結合在基底表面,再結合GNPS形成三明治結構(MNPs-2ndDNA探針-ETA基因-1stDNA探針-GNPs-條形碼DNA)。采用二硫蘇糖醇(DTT)處理后,三明治結構中的條形碼DNA被釋放,通過檢測此過程中產生的發光信號,可以間接得到ETA基因的含量。特異性實驗結果表明,與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌以及霍亂弧菌并無交叉反應,在最佳條件下,該方法檢出限為1.2 ng/mL。同樣采用納米技術,Amini等[34]還設計出另一種以核酸內切酶為基礎的生物傳感器,該技術采用檸檬酸鹽還原法制備GNPS,使其形成帶負電荷的納米粒子,因無法聚集而使其表面呈紅色。將紅色GNPS連接特異性探針后再與ETA基因雜交,此時在反應體系中加入BamHI核酸內切酶,直至將GNPS上目的基因全部切掉。在NaCl存在的條件下,GNPS不再帶負電荷而發生聚集而呈紫色,通過檢測過程中的顏色變化可以實現PA的定量檢測。在目標基因濃度達12.5 ng/mL時,可以憑肉眼觀察到明顯顏色變化。Ji等[35]研制出一種水平剪切表面聲波(SH-SAW)生物傳感器,其基本原理是在交流電信號刺激下,SH-SAW會沿壓電基片表面傳播。當傳播路徑上載荷的質量發生變化,SH-SAW的振幅和相速度將隨之變化,進而用這些變化來量化生物探針及其目標序列的特定雜交情況。該傳感器采用LiTaO3壓電基片,通過測定特異性ss-DNA探針與PA互補序列的結合產生的相位漂移來檢測PA,該傳感器對PA核酸的檢出限達9.5 ng/mL。雖然壓電晶體型生物傳感器有著操作簡單、節省時間等優點,但靈敏度還需要進一步提高。

從表1的實例中觀察,在醫學檢驗領域,各項研究中應用的樣本類型比較集中,樣本主要為血液、尿液或拭子樣本,LAMP方法和多重定量PCR方法在醫學樣本中應用已經可以實現不經過增菌直接檢驗,常用的靶基因都有較好的靈敏度,大多數文獻報道的檢驗方法都在這幾類樣本中應用較好,而Ertugrul等[36]的研究進一步表明,各個毒素基因中fliC和toxA基因保守性更好;環境領域的樣本,主要樣本類型為水樣,因為樣本成分相對簡單,因此各類檢測方法也有較好的應用效果;但在食品領域中,高脂肪、高蛋白和高鹽的環境會對分子方法的應用造成一定阻礙[37],因此針對這一領域的研究主要是液體類樣本,但由于菌體濃度限制,增菌或磁珠富集步驟仍然不可避免突破食品領域這一限制,如何最快富集PA,提高快速檢測的周期,方便監督機構迅速作出判斷,評估風險就顯得尤為重要。

3 以多肽、蛋白質為分析目標的檢測方法

目前,以多肽、蛋白質為基礎開展的檢測研究主要包括基于抗原抗體結合的免疫法和基于細菌胞膜成分或表達的特異蛋白進行鑒別的質譜、光譜分析法。

3.1 免疫傳感器

免疫分析法是通過用酶、熒光或放射性物質對抗體進行標記,在發生抗原抗體結合反應后放大免疫信號,從而實現對微生物進行鑒定。Bekir等[38]設計的免疫傳感器將多克隆抗PA抗體固定于吡咯-3-羧酸玻碳電極上,并采用循環伏安法、阻抗譜法監控實驗過程,實驗結果表明該傳感器靈敏度范圍達10～107CFU/mL。納米金(AuNPs)材料因能與之結合的生物大分子種類多,催化活性高且對電子的傳遞效率能有所提高,也廣泛應用在各類生物傳感器中。Krithiga等[39]將新型納米技術與傳感器技術相結合,研制的PA免疫傳感器采用鈣/果膠-納米金粒子修飾的玻碳電極固定單克隆抗體,檢出限達9×102CFU/mL,靈敏度范圍為10～107CFU/mL,并具有高穩定性、高選擇性、高重現性及高復用性等特點。Ellairaja等[40]根據熒光探針與葡萄糖-銀納米粒子結合時熒光信號減弱、熒光探針-葡萄糖-銀納米粒子-IgG結合時信號增強的原理,研制以納米銀技術為基礎的傳感器,通過監測與納米銀顆粒-探針復合物結合時增強的熒光信號完成PA的檢測,該傳感器最低檢測限達1.5 CFU/mL,并成功地完成水、土壤以及牛奶、果汁等食物中的PA檢測。

3.2 質譜分析技術

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)主要通過分析細菌胞膜成分或表達的特異蛋白對細菌進行種群的鑒別。第一版使用MALDI-TOF-MS鑒定微生物的指導方針CLSI M58已于2017年4月發布,這標志著業界已經認可將質譜技術作為主流技術用于微生物常規鑒定。崔學文等[41]用MALDI-TOF-MS對15株PA和8株干擾菌進行圖譜采集,應用BioTyper和FlexAnalysis對圖譜進行離子分析和比對鑒定,通過比較,MALDI-TOF-MS對15株PA鑒定結果和VITEK完全一致,這充分證明了這一技術的可靠性。Lüthje等[42]也成功地利用MALDI-TOF-MS對顯色培養基上386株菌(含PA)進行分析,檢測結果基本不會受到顯色培養基中特殊成分的干擾。Lin等[43]將血液PA陽性培養物經過兩段離心、溶血處理,利用MALDI-TOF-MS技術成功檢測到PA,大大縮短檢驗時間,降低了實驗成本。Pereira等[44]先利用掃描電子顯微鏡和原子顯微鏡來觀察玻璃及聚丙烯上形成的生物膜不同時期的形態變化,再利用MALDI-TOF-MS技術對不同材料上PA進行分析,根據樹狀圖進行聚類分析,結果表明,MALDI-TOF-MS技術能夠成功區分不同階段生長的PA。表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術也是通過檢測特異性蛋白來實現菌株的鑒別。肖代雯等[45]利用表面增強激光解析電離飛行時間質譜采集20株PA的蛋白指紋圖譜,在相對分子量4000～11000 Da范圍內進行篩選,初步建立以19個穩定表達的蛋白峰構成的蛋白指紋模型。對43株PA鑒定結果與傳統微生物學鑒定方法及分子生物學結果相比符合率為97.7%。

4 以代謝產物為分析目標的檢驗技術

PA生長過程中分泌的次生代謝產物種類繁多,如鼠李糖脂、胞外多糖、酶類化合物幾丁質酶、酸性磷酸酶[46]、碳青霉烯酶[47]。但在檢測領域,最受關注的次級代謝物是一類具有氧化還原活性的含雜氮環的小分子物質,統稱為吩嗪[48]。吩嗪類物質主要包括綠膿菌素(PYO)、吩嗪-1-羧酸、吩嗪1-甲酰胺、5-甲基吩嗪-1-羧酸等。但由于很多細菌都會產生吩嗪類物質,唯有PYO,不但具有特殊的氧化還原活性和有特殊的顏色,而且是一種僅由PA特異性產生的化合物[49],所以成為PA最理想的標志物之一。

4.1 電化學法

4.1.1 以綠膿菌素(PYO)為分析目標 以分析PYO間接檢測PA的方法主要采用電化學方法。其主要是通過將特定代謝物在基質中的電化學信號轉換成光電信號來實現的。Oziat等[50]以玻碳電極為工作電極,以Ag/AgCl電極為參比電極,以鉑箔作為對電極。利用循環伏安法和方波伏安法對4種主要代謝產物,2-庚基-4-喹諾酮(HHQ)、假單胞菌喹諾酮信號分子(PQS)、綠膿菌素(PYO)和2′-氨基苯乙酮(2-AA)的電化學特性進行了分析。結果表明,在低電位條件下HHQ和2-AA反應電位相近,較難區分,需要通過調整pH和提取樣本上清液才能達到較好的分離效果。因此PQS和PYO能在低電位下產生分離度較好的峰型,由此判斷這兩種代謝物是最適合電化學檢測PA的生物標志物。Sismaet等[51]設計的一次性絲網印刷電極傳感器由碳基工作電極和對電極輔以Ag/AgCl材料的參比電極組成,通過分析傷口排出物的方波伏安圖可以判斷是否存在綠膿菌素成分,當樣本中存在PA產生的綠膿菌素時,伏安圖中會出現明顯的峰。這種電化學方法無需樣品制備,只需要7.5 μL樣品,不到1 min時間即可完成分析。通過與16S rRNA測序結果比較,該傳感器對假單胞菌的檢測靈敏度可以達到71%。Webster等[52]設計的碳電極傳感器,以人血、尿液、痰和肺泡灌洗液樣本,檢測PA綠膿菌素完成一次檢測只需要5 min左右的時間,非常快捷,而且整個檢測是直接基于樣本進行的,不需要經過篩選分離PA的環節。Santiveri等[53]的研究進一步證明了綠膿菌素產生的電化學信號非常明顯,即使在PA與多種致病菌混合培養時,仍然能有效鑒別出PA。新型納米材料石墨烯因具有比表面積大、導電性良好、吸附力強、生物相容性高等特性,也被廣泛應用在PA電化學傳感器中。Gandouzi等[54]以石墨烯-金納米顆粒搭建傳感平臺檢測綠膿菌素,檢出限為0.33 μmol/L,在實際樣品人血清、唾液和自來水的檢驗中都有很好的應用效果。Cernat等[55]改用納米復合材料石墨烯-聚吡咯-納米金材料搭建傳感平臺檢測綠膿菌素,這種材料在電子轉移速率和增加活性表面積方面表現更突出,在靈敏度、自動化程度、價格成本等方面具有更大優勢。

4.1.2 以揮發性物質為分析目標 除了以綠膿菌素為研究對象外,Suarez-Cuartina等[56]利用電子鼻技術,通過對PA代謝產生的揮發性有機物質(VOC)的分析達到檢測的目的,具有檢測速度快、靈敏度高、操作簡單等特點。通過分析病人呼出氣體的揮發性有機成分就能確定PA的存在。但在靈敏度、穩定性方面,電子鼻的氣體傳感技術還需進一步提高。此外,如何在短時間內同時檢測多種微生物方面還需要進一步深入的研究。Kviatkovski等[9]設計的傳感器以PMT光電探測器捕捉由PA產生的2-氨基苯乙酮(2-AA)激活感應元件而發出的波長490 nm的藍光,通過與光電倍增管的結合實現對2-AA的檢測。在實際樣本檢驗中,通過收集外耳炎患者的耳中膿液樣本,該裝置能在2 nmol的水平上檢測到2-AA。因此得出揮發性2-AA可作為耳部感染PA的有效生物標記物。

4.1.3 以培養環境的變化為分析目標 電阻抗法也是近幾年發展起來的一種新型微生物快速檢測技術。Chabowski等[57]采用電阻抗法檢測PA,其設計的阻抗傳感器具體原理為當PA在培養基內生長繁殖時,PA的新陳代謝作用導致培養基內營養成分發生變化,隨之會導致培養基中的電導性和電阻抗能力發生改變,根據這種變化建模，從而通過測量這種PA變化幅度進行檢測。

4.2 色譜法

以色譜法對PA代謝物的分析也主要是圍繞PYO展開的。Fernandez等[58]以HPLC方法分析了PA的3種代謝物,包括1-羥基吩嗪(一種綠膿菌素降解物)和吩嗪-1-羧酸。該方法以PA菌液上清液為樣本,以C18柱分析可以在32.4 min處檢測到PYO出峰;董卉[59]建立了反向HPLC法,以乙酸乙酯萃取發酵液,以乙酸銨-乙腈作為流動相,在保留時間8.171～8.227 min內實現了對PYO的檢測,并實現與其他吩嗪類化合物的有效分離,PYO的最低檢出限達0.262 μg/mL;Reszka等[60]進一步建立了LC-MS方法分析PYO。該方法采用Waters Xbridge C18色譜柱分離,以甲酸-乙腈為流動相,保留時間3.69 min處出峰,5 kV噴霧電壓,275 ℃毛細管溫度完成PYO檢測。Hamerly等[61]采用LC-MS分析PAO1代謝產物,并首次應用MALDI-IMS質譜成像技術對人工模擬被PA感染小鼠熱損傷組織中化合物進行分析,確定銅綠假單胞菌和感染組織特有的代謝特征生物標志物,成功實現了原位檢測組織中PA。

5 以全細胞為分析目標的檢驗技術

與動物細胞和植物細胞相比,PA的單個細胞相對較小,因此適用于PA全細胞檢測的研究方法相對較少。為了實現對PA的分離鑒定,目前收集到的分析方法主要有以下三種:采用流式細胞術對單個菌體染色后分析、選擇與PA細胞結合率高的適體,分析適體結合后生成的光電信號或采用拉曼光譜對含PA生物量較多的單菌落進行分析。

流式細胞術基于熒光激活細胞法,使細菌準確迅速的進入標準的96或384孔板,然后將被熒光色素染色的測量菌體用高能量激光照射,通過觀察在高速流動狀態下的菌體產生的散射光和發射熒光的強度和波長變化,從而實現對不同菌株的定性或定量檢測。Chakotiya等[67]為研究生姜對PA活力的影響,利用熒光染料碘化丙啶(PI)的膜滲透能力,實現了用流式細胞術對完整PA和細胞膜破損PA的區分。Rüger等[68]將qT-RFLP與流式細胞術相結合,用免疫熒光單克隆抗體標記洋蔥伯克霍爾德菌,以麥胚凝集素標記金黃色葡萄球菌,同時利用碘化丙啶PI標記細胞膜破損的死菌,以SYBRGreen I能選擇性地標記雙鏈DNA的特點,實現區分共培養的PA、洋蔥伯克霍爾德菌和金黃色葡萄球菌3種菌,并能動態監測3種菌的死菌和活菌的比例。

核酸適體是一種幾乎能與抗體相媲美的單鏈核酸分子,它是由SELEX技術篩選出來的能與靶分子特異性結合的DNA或RNA,并且其適用的靶分子范圍廣泛,不僅局限于核酸、抗體、金屬離子,甚至可以和細胞體特異性結合[69]。Kim等[70]分別采用量子點和異硫氰酸熒光素FITC標記適體生物探針,利用適體與PA菌體結合時產生的熒光信號的變化來確定水中PA的污染程度。實驗結果表明,與QD標記的適體相比,FITC標記的適體與菌體結合能力更高。最適孵育時間為30 min,檢出限達5.07 cell/mL。Shi等[71]以磁珠/適體/多聚腺苷DNA為一體的“三明治結構”實現了對PA的選擇性結合。當樣品中存在PA時,由于適體對PA的特異性吸附,“三明治結構”中的多聚腺苷DNA會被PA取代。被釋放的多聚腺苷DNA遇到納米金粒子時會產生特殊的傳感信號,通過對信號的分析從而間接實現對PA的檢測。該方法在緩沖液中檢出限可達9 CFU/mL,模擬血樣中為52 CFU/mL。

6 結論與展望

在醫學界,對耐藥性銅綠假單胞菌的檢驗是主要關注點,但在環境領域和食品化妝品檢驗領域,如何能即時、快速、簡單、準確地完成實驗,以達到監測監管領域對檢驗時效的要求,則是研究者對檢驗方法的終極追求。

本文主要對近幾年應用于不同領域的PA檢驗方法進行了綜述。對于PA檢驗而言,分子生物學方法、蛋白免疫方法,幾大類儀器分析檢測手段幾乎都已經可以實現各類樣品的定性檢驗,但是以質譜色譜技術為基礎的檢驗技術儀器成本相對較高,生物傳感器類檢驗方法在靈敏度方面略顯不足,但隨著與各種新技術的組合優化過程,相信各類生物傳感器在與磁珠富集法的組合后,便攜簡單快速的生物傳感檢測法會具有很好的應用前景;在定量檢驗方面,傳統方法以及發展較早的分子生物學方法、免疫學方法依然具有很明顯的優勢。就樣本類型而言,環境樣本和醫學樣本相對簡單,而食品類樣本具有液態、固體、凝膠等多種狀態,這種特性常會對分離和確認產生干擾,因而實現快速定量檢測食源性微生物比臨床上診斷和環境樣品檢測面臨更多的挑戰。Karami等[72]的研究表明,環境中分離出的和臨床分離株在傳播方面顯著相關。環境中檢出的PA也有耐藥性,這說明在環境和食品領域中的PA檢測需要更多的重視,尤其應多關注建立適合的檢測耐藥性PA的方法。

隨著時代的高度發展,新技術、新儀器不斷涌現,各種檢驗技術融合度也不斷提高,單純地使用任何一種方法都無法滿足多方面的要求。目前新型的檢驗方法多是在基礎的檢驗方法上改進了前處理方法或改變了數據收集方式,再或者是在各種技術融合應用的基礎上開發的新方法,已經很難定義某項研究具體屬于哪類檢驗領域。但層出不窮的檢驗方法也存在缺乏相關產品標準和質量標準以衡量具體方法有效性、適用性的問題,因而將現行前沿技術應用于實際檢驗中還有很長的路要走。在研究者不斷的探索與創新中,PA的檢驗才能不再受時間、地點、操作人員等條件的限制,才能實現高效檢測,由此才能實現最大程度地降低PA對人類身體健康帶來的危害。