酶底物法檢測水中總大腸菌群

田立平, 邢峰杰, 王曉波

(濰坊市市政公用事業管理處，山東濰坊261041)

與傳統的多管發酵法、濾膜法相比，采用酶底物法檢測總大腸菌群具有操作簡便、檢測時間短、無需進行確認試驗等優勢，廣泛應用于水質檢測等行業。酶底物法和濾膜法、多管發酵法對總大腸菌群的檢測結果具有一致性，不存在統計學差異[1-4]。筆者結合實際情況，對酶底物法檢測總大腸菌群過程中的質量控制因素進行了研究，以期為今后的工作提供參考與支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

科立得試劑、97孔定量盤、97孔陽性比色盤、程控定量封口機、DHP-9080電熱恒溫培養箱。

實驗室用水：采用MilliPore純水系統制備純水，經平皿計數等實驗檢測符合實驗要求。使用時用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，制成無菌水。

1.2 樣品來源

濰坊市峽山水庫地表水、濰坊市某地區地下水、濰坊市中心市區管網水以及飲用水總大腸菌群質控標樣(批號為022718-1和021518)。

1.3 檢測方法

根據《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750.12—2006)中的酶底物法和《城鎮污水水質標準檢驗方法》(CJ//T 51—2018)中的酶底物法進行檢測。

2 結果與分析

在采用酶底物法檢測飲用水總大腸菌群過程中，實驗室內的質量控制硬件主要包括電熱恒溫培養箱、冰箱、立式高壓蒸汽滅菌器以及培養基等。在電熱恒溫培養箱和冰箱的使用過程中，采用檢定合格的溫度記錄儀測定溫度，控制箱內溫度與設定溫度差在±0.5 ℃內；定期用化學指示卡或者生物滅菌指示劑，檢測立式壓力蒸汽滅菌器的滅菌效果；培養基例如科立得試劑在使用前，進行大腸埃希氏菌標準菌株陽性實驗和無菌性測試。質控樣品標準值為91±12 MPN/100 mL，從表1可以看出驗證合格。軟件方面影響因素主要包括檢測時間、取樣容器、培養時間以及檢測環境等。影響因素中的生物實驗先進行空白實驗，例如純水、培養基等。

表1 科立得試劑符合性驗證 MPN·100 mL-1

2.1 檢測時間對檢測結果的影響

微生物樣品所規定的保存時間為4 h[5]，但實際工作中會存在因外出取樣路程太遠等情況，不能在4 h內及時檢測。針對全年溫度變化，采用實際水樣和質控樣品對冬天(4 ℃)、春秋(20 ℃)以及夏天(35 ℃)取樣運輸過程中保存時間對結果的影響進行分析。

2.1.1 實際水樣

采用無菌水對污水出廠水按一定比例稀釋、混勻，配制得到試驗水樣。對同一水樣，在不同保存溫度和時間下的檢測結果如圖1所示。20和35 ℃條件下水樣保存2 h后，結果變化很大；隨著時間的延長，結果呈現無規律變化；4 ℃下冷藏保存24 h內，檢測結果穩定，而24 h后呈現無規律變化。

圖1 檢測時間對實際水樣總大腸菌群檢測結果的影響

2.1.2 總大腸菌群質控樣品

用已滅菌的管網水將總大腸菌群質控樣稀釋10倍，稀釋后的標準值為9.1±1.2 MPN/100mL，可接受范圍為2.9～28.4 MPN/100mL。從圖2可以看出，在4 h內對4，20和35 ℃下保存水樣的檢測結果比較穩定。隨著時間的延長，20和35 ℃下保存的水樣的檢測結果顯著變化，4 ℃冷藏條件下的水樣在24 h內結果變化不大，且隨后均呈現下降趨勢。

圖2 檢測時間對總大腸菌群質控樣檢測結果的影響

2.2 取樣容器對檢測結果的影響

目前常用的微生物取樣容器有玻璃瓶、無菌塑料瓶、無菌采集袋等，而微生物具有吸附性，存放過程中不同的容器對檢測結果的影響程度可能存在差別。采用生活飲用水管網水、地表水、地下水、質控樣品共4類11個樣品對這3種容器分別進行試驗，其中質控樣品批號為022718-1，用已滅菌的實際水樣稀釋10倍，結果見表2。通過SPSS軟件配對t檢驗分析，p>0.05，3種容器的檢測結果不存在顯著差異。

表2 取樣容器對檢測結果的影響 MPN·100 mL-1

2.3 培養時間對檢測結果的影響

對總大腸菌群質控樣品(標準值為91±12 MPN/100mL)進行酶底物法檢測，不同培養時間后的檢測結果如圖3所示。培養22～28 h后的檢測結果在標準值附近，用SPSS軟件分析表明，培養15～21、29～33 h后的檢測結果與標準要求的24 h相比均有顯著性差異，因此檢測總大腸菌群最佳的培養時間為22～28 h。

圖3 培養時間對檢測結果的影響

2.4 檢測環境對檢測結果的影響

取生活飲用水管網水、地表水、地下水和總大腸菌群質控樣品4類水樣，其中總大腸菌群質控樣品標準值為214±17 MPN/100 mL，可接受度范圍為69～668 MPN/100 mL。對每類樣品分別在無菌環境和非無菌潔凈室條件下進行檢測，結果見表3。通過SPSS軟件配對t檢驗分析p>0.05，4類水樣7個樣品在無菌環境和非無菌潔凈室下的檢測結果差異不顯著，酶底物法檢測總大腸菌群對檢測環境無嚴格要求。

表3 不同檢測環境下的總大腸菌群檢測結果 MPN·100 mL-1

3 結論

① 微生物樣品采集后若不能在4 h內完成總大腸菌群的檢測，須立即置于4 ℃冷藏保存，并在24 h內完成檢測，在夏季高溫和春秋季取樣時要特別注意。

② 取樣采用玻璃瓶、塑料瓶和采集袋，對總大腸菌群檢測結果的影響程度無顯著差異。但考慮到塑料瓶和采集袋易破損等因素，建議首先選擇硬質玻璃瓶取樣。塑料瓶和采集袋為一次性無菌取樣容器，可在應急樣品取樣或大批量的取樣缺乏足夠滅菌玻璃瓶的情況下使用。

③ 采用酶底物法檢測總大腸菌群，培養時間宜控制在22～28 h。該方法對所處環境是否無菌無嚴格要求，可以應用于室外應急檢測工作。