銅綠微囊藻衰亡過程中產甲烷動態及關鍵影響因子

劉藝，許浩廉，毛羽豐，李宏，艾海男，何強

(重慶大學 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400045)

湖泊生態系統是內陸水域中CH4產生的源頭之一，其CH4釋放量占到自然源CH4釋放總量的16%～24%[1-3]。尤其在初級生產力較高的富營養化湖泊中，CH4和CO2的釋放量會顯著增加[4-5]，可見，水華藻類衰亡對湖泊碳素釋放的貢獻不可忽視。

目前，對于水華藻類衰亡的研究主要集中在藻類衰亡對水環境的影響[6-8]，以及由此帶來的對沉積物物質釋放[9]和水生植物生理生態[10-11]的影響。實際上，藻類衰亡在改變水環境條件的同時，勢必會影響其中的碳代謝過程。West等[12]對比了黑暗密閉條件下斜生柵藻和楓葉對溫帶湖泊產CH4的影響，得出藻源有機質(AOM)比陸源有機質對水生系統產CH4的促進作用更為顯著。Grasset等[13]研究了黑暗密閉條件下藍綠藻和3種植物葉片對淡水沉積物產CH4和CO2的影響，發現藍綠藻對產CH4和CO2的促進作用最強。以上研究均在黑暗密閉的條件下進行，為了更客觀地反映藻類自然衰亡過程，Lenhart等[14]通過室內試驗模擬了自然光照下赫氏顆石藻的衰亡，得到赫氏顆石藻碳素對CH4產生有貢獻作用。Liang等[15]通過室內試驗發現，在自然條件下絲狀藻衰亡能顯著促進CH4的釋放。以上研究雖然模擬了藻類的自然衰亡，但較多地注重碳素釋放的結果，對于水華藻類衰亡各階段碳素釋放的特點，藻華堆積區藻快速衰亡和自然衰亡過程下CH4產生量的差異，以及環境因子和AOM各組分對產CH4的貢獻還鮮有報道。

以銅綠微囊藻為研究對象，通過室內模擬試驗，研究高密度銅綠微囊藻自然衰亡和快速衰亡過程中產CH4過程，以及影響CH4和CO2釋放的主導環境因子，以期進一步認識銅綠微囊藻水華對湖泊碳行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗原水采集于重慶大學民主湖(29°34′00″N，106°27′57″E)，經0.22 μm濾膜減壓過濾，以去除原水中自帶的藻類。在原水采集點采集深度小于10 cm的表層沉積物，混合均勻。

試驗所用銅綠微囊藻(FACHB-905)購于中國科學院武漢水生生物研究所。用BG-11培養基對藻種進行擴大培養，培養至穩定生長期的藻離心后用15 mg/L的NaHCO3溶液洗滌，加入濾后原水配成藻類干密度為0.70 g/L的新鮮藻液[6]。采用細胞破碎儀(JY92-IID，新芝)對新鮮藻液進行超聲破碎處理，以模擬藻華堆積區藻的快速衰亡過程，超聲在冰浴中進行，避免超聲使蛋白等物質變性[16]。

1.2 實驗裝置及處理

藻類衰亡試驗在500 mL血清瓶中進行，如圖1所示。每瓶由200 mL沉積物、300 mL藻液或濾后原水、125 mL頂空組成。試驗設置3組處理：新鮮藻組，模擬藻華的自然衰亡(含300 mL新鮮藻液)；破碎藻組，模擬藻華的快速衰亡(含300 mL破碎藻液)、對照組(含300 mL濾后原水)，各處理設置3個重復。

血清瓶瓶口用無菌培養透氣膜密封，沉積物四周用黑色遮光紙覆蓋，避免光照的影響[17]，放置在恒溫光照培養箱中，保持溫度(25±1.5)℃，最高光照度4 000 lx，光暗比12 h∶12 h。體系穩定1 d后開始試驗。

試驗持續41 d，每隔3～5 d測定上覆水pH、氧化還原電位(ORP)、溶解氧(DO)、葉綠素a(Chl-a)，同時測定當天CH4和CO2的釋放通量。在第1、7、21、41 d測定DOC和溶解性有機質的三維熒光光譜(EEM)。

1.3 指標及測試方法

1.3.1 水環境指標的測定 pH值用pH計(SevenCompact，METTLER)測定，ORP用ORP復合電極(LE501，METTLER)測定，DO用便攜式溶解氧儀(HQ40d，HACH)測定。Chl-a采用丙酮提取法[18]測定。水樣經濾膜過濾，用總有機碳分析儀(LiquiTOC-II，ELEMENTAR)測定DOC含量。EEM采用熒光分光光度計(F-7000，HITACHI)測定，用熒光區域積分法(FIR)[19]進行定量分析。

1.3.2 CH4和CO2的采集和測定 CH4和CO2氣體的采集和測定參考浮箱法[20]，用裝有三通閥的瓶蓋密封瓶口，用注射器通過三通閥抽取30 mL氣體儲存于采樣袋中，間隔1 h后再次采氣，CH4和CO2氣體的濃度用氣相色譜儀(GC1690，杭州捷島)進行分析。氣體釋放通量F(μmolC/(m2·h)按式(1)計算。

(1)

式中：C0為初次采樣的氣體濃度，μmolC/L；Ct為t時刻采樣的氣體濃度，μmolC/L；V為血清瓶頂空體積，L；Vs為氣體采樣體積，L；T為采樣的時間間隔h；A為水-氣界面的表面積，m2。

1.4 數據分析

水環境指標和氣體指標之間的相關性用皮爾遜(Pearson)相關系數法進行分析，各處理組指標的顯著性差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗。Chl-a衰減常數采用一階指數衰減模型[21]進行擬合。

2 結果與討論

2.1 銅綠微囊藻衰亡中水環境參數的變化

2.1.1 Chl-a的變化 Chl-a濃度是藻類生長和衰亡的標志[9]。如圖2所示，加入藻液后，新鮮藻組和破碎藻組的Chl-a濃度分別達到了8.59 mg/L和7.88 mg/L，遠高于藍藻水華暴發的閾值濃度[22]，模擬了高濃度銅綠微囊藻水華暴發的情況。反應前4 d，加藻組的Chl-a降低速率最大，表明藻類在前4 d衰亡速度最快。反應13 d后，加藻組的Chl-a濃度與對照組一樣維持在較低值，此時藻類基本完全衰亡。

新鮮藻組的Chl-a衰減常數為0.36 d-1，破碎藻組為0.83 d-1，表明經過超聲處理后，快速衰亡的速率提高為自然衰亡的2倍以上。

圖2 銅綠微囊藻衰亡過程中Chl-a的變化Fig.2 Variations in Chl-a during the decay of

2.1.2 ORP的變化 如圖3(a)所示，對照組的ORP在整個試驗中變化不大，維持在(134±34)mV。試驗第1 d，新鮮藻組和破碎藻組的ORP迅速下降到5 mV和-280 mV。第4～10 d，加藻組的ORP呈下降趨勢，在第10 d分別達到極低值-183 mV和-190 mV。第10～21 d，ORP開始回升，并在第31 d后回升到與對照組相當的水平。

破碎藻組在第1 d的ORP顯著低于新鮮藻組，藻快速衰亡釋放出還原態物質可能是破碎藻組初始ORP極低的原因[10]。試驗前21 d，新鮮藻組的ORP始終高于破碎藻組，可能是新鮮藻組在緩慢衰亡過程中，存活的藻細胞光合作用釋放出O2，部分補償了DO消耗導致的ORP下降。

2.1.3 DO的變化 如圖3(b)所示，對照組的DO在整個試驗中維持在(6.57±1.03)mg/L的好氧狀態。試驗第4～21 d，加藻組的DO均維持在1 mg/L以下的缺氧狀態，顯著低于對照組。尚麗霞等[8]在研究藍藻分解中發現，高濃度藻液在12 h內就能由好氧轉化為厭氧(DO<0.5 mg/L)狀態。吳婷婷等[10]在藍藻堆積衰亡中也觀察到1 d內DO快速降低到缺氧狀態的現象。表明高濃度銅綠微囊藻衰亡會快速消耗水中DO，致使水體由好氧轉變為缺氧狀態。第21 d后，由于AOM的消耗，DO開始回升，并在31 d后上升到與對照組相當的水平。

與破碎藻組相比，新鮮藻組的DO在第1 d達到16.93 mg/L的超飽和狀態，與羅宜富等[23]在調研阿哈水庫藻類大量繁殖期水相DO濃度相似。試驗4～13 d，加藻組的DO均較低(DO<0.52 mg/L)且相差不大。

2.1.4 pH的變化 如圖3(c)所示，試驗中對照組的pH維持在7.78±0.34的中性值附近。加藻后第 1 d，新鮮藻組的pH上升至10.16，破碎藻組pH略微升高為8.13。破碎藻組引起pH升高是由于銅綠微囊藻分解的AOM是弱堿性物質[24]，而新鮮藻組初始pH顯著高于破碎藻組則是大量新鮮銅綠微囊藻光合作用吸收CO2釋放O2導致的[23]。第4 d后，微生物分解AOM產生了大量有機酸[10]，加藻組的pH均逐漸降低。13 d后由于AOM的減少和CO2的擴散消耗，pH逐漸回升，并在31 d后上升到與對照組相當的水平。

圖3 銅綠微囊藻衰亡過程中ORP、DO和pH的變化Fig.3 Variations in ORP, DO and pH during the decay

在銅綠微囊藻衰亡過程中，ORP、DO、pH的變化趨勢表現出了時間上的一致性，結合Chl-a的變化，可將衰亡劃定為4個時期：第1～4 d是鮮藻組和破碎藻組各指標差異最大的時期，為快速衰亡期；第4～13 d是加藻組與對照組各指標差異最大的時期，且3種水環境指標均隨時間降低，為緩慢衰亡期；第13～31 d加藻組與對照組差異仍然顯著，但3種指標隨時間而逐漸回升，為完全衰亡前期；第31～41 d加藻組的3種指標恢復到與對照組相當的水平，為完全衰亡后期。

2.2 銅綠微囊藻衰亡中有機質的變化

破碎藻組DOC初始和峰值濃度均顯著高于新鮮藻組，表明藻類快速衰亡促使AOM更快地釋放到水中[26]。第41 d，新鮮藻組的DOC最終降解量(47.29 mg/L)與破碎藻組(47.77 mg/L)相當。

圖4 銅綠微囊藻衰亡過程中上覆水DOC濃度的變化Fig.4 Variations in DOC concentration of overlying water during the decay of Microcystis

用特定區域標準化的百分熒光響應(Pi,n)衡量DOC成分的相對變化，如圖5所示。對照組的初始DOC成分以類富里酸(區域Ⅲ)和類腐殖酸(區域Ⅴ)為主，表明天然水體的腐殖化程度較高。與對照組相比，加藻組的初始芳香蛋白類物質(區域Ⅰ、Ⅱ)和溶解性微生物代謝產物(區域Ⅳ)占比明顯較高，表明銅綠微囊藻衰亡釋放到水體中的AOM主要是芳香蛋白類物質，包括酶、藻青蛋白、氨基酸等[27]。隨著AOM的溶出，加藻組的芳香蛋白類物質和溶解性微生物代謝產物的占比不斷增加，在第7 d達到最大值。第7 d后，對照組和加藻組的芳香蛋白類物質、溶解性微生物代謝產物的占比逐漸減少，類富里酸和類腐殖酸的占比逐漸增大，表明銅綠微囊藻衰亡釋放的不穩定性蛋白類物質逐漸被分解轉化為富里酸和腐殖酸等強穩定性有機物[24, 28-29]。

圖5 銅綠微囊藻衰亡過程中DOC特定區域百分熒光響應(Pi,n)的變化Fig.5 Variations in the percent fluorescence response (Pi,n) in a specific region of DOC during the decay of

2.3 銅綠微囊藻衰亡中CH4和CO2氣體的變化

2.3.1 CH4釋放通量和累積釋放量 如圖6(a)所示，試驗中對照組CH4釋放通量較低(0.211±0.313)μmolC/(dm2·d)。第1～4 d，加藻組的CH4釋放通量相比對照組有少量增加，但差異不明顯。從第7 d開始，新鮮藻組和破碎藻組的CH4釋放通量快速增加，并在第13 d達到最大，分別為13.699 μmolC/(dm2·d)和43.626 μmolC/(dm2·d)。第13 d后，加藻組的CH4釋放通量逐漸降低，并在第31 d降低到與對照組相當的水平。

從圖6(b)的CH4累積釋放量來看，新鮮藻組和破碎藻組的CH4累積釋放量分別為對照組的22.80倍37.72倍，表明高密度銅綠微囊藻衰亡顯著促進了系統CH4的釋放。

2.3.2 CO2釋放通量和累積釋放量 與CH4釋放通量不同，對照組在試驗過程中存在明顯的CO2釋放量(5.229±4.983)μmolC/(dm2·d)。第1～4 d，2個處理組的CO2釋放通量均較低且無顯著差異。從第7 d開始，CO2釋放通量均迅速增加，對照組在第13 d達到最大釋放通量16.295 μmolC/(dm2·d)。新鮮藻組和破碎藻組分別在第10 d和第13 d達到最大釋放通量，分別為98.686 μmolC/(dm2·d)和60.184 μmolC/(dm2·d)，顯著高于對照組。第13 d后，3個處理組的CO2釋放通量迅速降低，并在第31 d后降低到各自的最低值附近。

如圖6(d)所示，新鮮藻組和破碎藻組的CO2累積釋放量分別為對照組的5.36倍和4.03倍，表明高密度銅綠微囊藻衰亡在促進CH4釋放的同時，也促進了CO2的生成和釋放。

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產氣和水環境因子的變化遵循著相似的時間模式，根據CH4和CO2釋放通量的變化，可將產氣劃分為4個時期：第1～4 d幾乎沒有氣體產生為產氣適應期；第4～13 d為產氣上升期；第13～31 d為產氣下降期；第31～41 d氣體產生強度降低到較低的狀態，為產氣末期。

2.3.3 自然和快速衰亡中氣體釋放的差異 如圖6(f)所示，加藻組的總C釋放量顯著高于對照組，但兩加藻組之間差異不大，與兩組第41 d的DOC降解量相當的結果一致，表明藻華堆積區藻的快速衰亡對碳素的總礦化效應幾乎沒有影響。

雖然加藻組在總C累積釋放量上差異不大，但在氣體釋放的相對比例上存在顯著差異。破碎藻組釋放的氣體中CH4的占比明顯高于新鮮藻組，總C中27.49%是以CH4的形式釋放的，而新鮮藻組釋放的總C中CH4僅占14.74%。表明高密度銅綠微囊藻衰亡的不同過程可導致碳素歸趨的差異。

圖6 銅綠微囊藻衰亡過程中CH4和CO2釋放通量和累積釋放量的變化Fig.6 Variations in release fluxes and cumulative release of CH4 and CO2 during the decay of Microcystis

作為生態系統呼吸作用的兩種產物，CH4和CO2之間的關系表現為，一方面CO2是還原CO2產甲烷途徑的底物，也是乙酸途徑和嚴格甲基營養型途徑產甲烷過程中的副產物[30]；另一方面，甲烷氧化菌可以利用CH4作為碳源，將CH4氧化為CO2。DO通常被認為是調控CH4在生態系統總呼吸作用中占比的主要因素[31]。但在第13 d，即破碎藻組的CH4釋放通量與新鮮藻組差異最大時，DO不存在顯著性差異(p=0.148)，原因可能是在缺氧或厭氧環境下，DO儀往往無法發揮其作用[32]。與之相反，ORP在此時的差異顯著(p=0.005)，說明在高密度銅綠微囊藻衰亡過程中，ORP在調節CH4和CO2的分配上可能起到重要作用。

自然衰亡和快速衰亡下，CH4和CO2氣體占比不同還可能是前期塑造的細菌群落差異造成的。Shi等[6]研究了水華藍藻長期作用下水相細菌群落的動力學，發現藍藻衰亡的不同階段細菌種群結構有明顯差異，在功能層面表現為與甲烷代謝有關的菌種在衰亡中逐漸增加。Schwarz等[33]基于加藻后沉積物的16s rRNA的研究發現，加入藻源碳的處理組在培養6 d后細菌群落就出現了顯著變化，其中，乙酸利用型產甲烷菌在加藻6 d后就有了增長，說明微生物群落對AOM可產生快速響應。由此推測，藻華堆積區藻的快速衰亡使大量AOM在試驗第1 d就釋放出來，導致加藻組在快速衰亡期水環境因子出現顯著差異，前期的環境差異使破碎藻組可能積累了較多的產甲烷菌，從而在產氣時期釋放出更多的CH4。

2.4 影響碳素釋放的主導環境因子

環境因子和氣體釋放通量的Pearson相關性如表1所示，除Chl-a與氣體釋放沒有顯著的相關性外，ORP、DO、pH、DOC均是顯著影響CH4和CO2釋放通量的關鍵環境因子。

表1 環境因子和氣體釋放通量的相關性分析Table 1 Correlation analysis of environmental factors and gas release fluxes

注：*代表相關性在0.05水平上顯著；**代表相關性在0.01水平上顯著。

Chl-a與CH4和CO2的釋放通量沒有顯著相關性，原因是氣體釋放的峰值強度往往出現在藻類衰亡釋放出AOM之后[15]，而此時Chl-a已經降到低值。

O2是還原產能最高的末端電子受體[31]，因此，DO與CH4釋放通量的相關性比ORP更大。產甲烷代謝中的輔酶因子和酶具有氧敏感性[36]，O2的存在會對該類酶產生抑制作用，從而抑制CH4的產生。Borrel等[36]指出，O2濃度超過10 ppm甲烷產生會被完全抑制，而唐千等[2]研究表明，一般情況下O2濃度高于0.7 mg/L產甲烷菌活性就會被完全抑制，這與試驗中新鮮藻組在第26 d時DO突然升高對應其CH4釋放通量突然降低是一致的。此外，DO還會促進好氧甲烷氧化過程，使生成的CH4被氧化為H2O和CO2。在富營養化嚴重的河流中，高濃度藻類衰亡在短時間內就能將水體由好氧狀態轉化為缺氧狀態[8, 10]，從而促進CH4的產生。

pH對CO2釋放通量的相關系數大于CH4。一方面，在產氣上升期，水體處于厭氧狀態，AOM被微生物厭氧分解為小分子有機酸[10]，致使pH降低的同時為CH4和CO2的產生提供了底物。另一方面，當溫度一定時，pH與水體二氧化碳分壓(pCO2)存在指數函數關系[37]，而水相pCO2又與水氣界面CO2通量存在函數關系(F=k(Csur-Ceq))[38]，因此，pH在一定程度上直接反映了CO2釋放通量的大小。

DOC與CH4和CO2釋放通量均有較顯著的相關性(p<0.05)。Liang等[15]在絲狀藻衰亡產氣試驗中也發現DOC與CH4釋放通量之間有很強的相關性(r2=0.70,p<0.000 1)。Stanley等[31]在綜合全球河流的數據后，也得到DOC與CH4濃度有顯著線性相關性(r2=0.19,p<0.001)的結論。AOM為水生生態系統中微生物的呼吸和代謝提供了足夠的底物，促進了CH4和CO2的釋放。盡管加入的AOM可能對沉積物中有機質的礦化產生正向激發作用，但Grasset等[13]通過δ13C同位素分析表明，比起AOM作為底物對CH4的貢獻，沉積物的正向激發可以忽略不計。此外，CH4和CO2的釋放通量與區域I、II和IV的占比成正相關，表明在AOM組分中，芳香蛋白類物質和溶解性微生物代謝產物易被微生物分解，對氣體的產生具有促進作用。其中，溶解性微生物代謝產物對兩種氣體釋放的促進作用最大。相反，CO2和CH4的釋放通量與區域III和V的占比成負相關，一方面因為類富里酸和類腐殖酸成分通常被認為是頑固性組分，較難被微生物利用[24]；另一方面部分腐殖酸還會對CH4的產生有抑制作用[39]。

銅綠微囊藻衰亡中，DOC與CH4和CO2釋放通量的相關性最大，結合藻類衰亡過程中環境因子的變化，可以推測出銅綠微囊藻衰亡促進碳素釋放的機理：高密度銅綠微囊藻在衰亡中釋放出大量新鮮有機物，這些有機物中的不穩定組分為微生物提供了底物，促進其分解代謝釋放出CH4和CO2。尤其對于CH4的產生而言，釋放出的有機物不僅提供了分解底物，還通過增加水中還原物質含量和促進需氧型微生物代謝的途徑降低ORP和DO，為CH4的產生創造了合適的厭氧環境。

3 結論

1)高密度銅綠微囊藻自然衰亡和快速衰亡中Chl-a、水環境因子和產氣的變化遵循著相似的時間模式。藻的衰亡可劃分為：快速衰亡期(1～4 d)、緩慢衰亡期(4～13 d)、完全衰亡前期(13～31 d)、完全衰亡后期(31～41 d)，產氣階段與之對應。

2)AOM的輸入可增加試驗體系的CH4產量。銅綠微囊藻自然衰亡和快速衰亡下CH4累積釋放量分別為對照組的22.80、37.72倍，CO2的累積釋放量分別為對照組的5.36、4.03倍。

3)銅綠微囊藻自然衰亡和快速衰亡過程中總C釋放量無明顯差異，但快速衰亡下AOM的迅速釋放顯著改變了藻源碳素的歸趨。表現為快速衰亡下釋放的氣體組分中CH4的占比是自然衰亡下的1.86倍，且總C中27.49%是以CH4的形式釋放的，而自然衰亡釋放的總C中CH4僅占14.74%。

4)銅綠微囊藻的衰亡顯著增加了水體中的藻源碳素，提升了微生物產CH4和CO2代謝的底物，并為產CH4微生物創造了合適的厭氧環境，使得DOC成為影響CH4和CO2釋放的主導環境因子。在DOC組分中，芳香蛋白類物質和溶解性微生物代謝產物是CH4和CO2產生的主要底物來源。