硫化氫可通過改善肺動脈內皮間質轉化減輕野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓

張 卉， 藺艷軍， 毛承譽， 潘建安， 張繪莉

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院心內科，上海 200001

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一種由多種病因引起的以肺動脈血管壓力持續升高及肺血管重構為特征的慢性進行性疾病。這種疾病嚴重限制了右心室的功能，并導致右心功能衰竭，甚至死亡[1]。內皮間質轉化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)是一種復雜的生物學過程，即內皮細胞失去內皮細胞特異性蛋白的表達，呈現典型的間充質細胞形態和功能，獲得細胞運動性和收縮性[2]。EndMT不僅參與胚胎發育過程，還與炎癥、纖維化、PAH等疾病密切相關[3-7]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種細胞內氣體信號分子，通過蛋白質過硫化物的形成或蛋白質硫化水解參與多種生理和病理過程[8-9]。H2S參與調節細胞凋亡、細胞周期和氧化應激，在心血管系統中具有重要的生理作用[10-13]。研究[14-15]表明，H2S可減輕肺血管重構和PAH。然而，H2S與PAH中EndMT之間的關系鮮有報道。因此，本研究擬通過大鼠PAH模型和細胞研究，探討H2S能否調控肺動脈EndMT過程，及其與H2S抗PAH作用之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只SPF級雄性SD大鼠，10周齡，體質量(250±15) g，由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物房提供。大鼠適應性喂養2 d后，隨機分為對照組、模型組、硫氫化鈉(NaHS)組和炔丙基甘氨(PAG，H2S合成抑制劑)組，每組10只。除對照組給予0.9%氯化鈉溶液注射外，其他3組動物一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg制備PAH模型，注射7 d后分別腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液、NaHS 1 mg·kg-1·d-1、PAG 10 mg·kg-1·d-1。

1.2 細胞培養及分組 人肺動脈內皮細胞(HPAECs)購自ScienCell公司。細胞在含有5%的胎牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素和1%內皮細胞生長因子的內皮細胞培養基(ECM)中培養，在干預24 h前接種于6孔板中。干預前，用無血清培養基沖洗細胞2次，將細胞分別予以0.9%氯化鈉溶液或硫氫化鈉NaHS 50、100、200 μmol/L預處理2 h；以轉化生長因子β1(TGF- β1)10 ng/mL分別刺激1 h、3 d、10 d，收獲細胞。分別觀察Snail、血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達水平和細胞形態學變化。

1.3 大鼠血流動力學和右心室肥厚指標測定 大鼠經腹腔注射4%水合氯醛0.9 mL/kg麻醉后[14]，暴露右側頸外靜脈并將PE導管引導通過上腔靜脈、右心房、右心室進入肺動脈。通過BL-420S生物機能實驗系統，將導管體外末端連接到壓力傳感器以記錄肺動脈壓的連續變化，包括收縮期肺動脈壓(PASP)、舒張期肺動脈壓(PDSP)和平均肺動脈壓(mPAP)。處死大鼠后，分離和洗滌大鼠心臟，沿房室溝銳性剪掉左右心房組織，分別剪取右心室游離壁(RV)及左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去心室表面血液后稱質量，計算右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。RVHI=RV/(LV+S)，RVHI>0.33時表示右心室肥大。

1.4 蘇木精-伊紅(H-E)染色觀察大鼠肺血管結構變化 將大鼠肺組織于4%多聚甲醛中固定后，石蠟包埋切片(5 μm)，脫蠟和水化后行H-E染色。在光學顯微鏡(200倍和400倍)下觀察血管外徑為50～100 μm的小血管。采用Image J圖像分析軟件測量肺小動脈管壁厚度。

1.5 免疫印跡檢測蛋白的表達 將稱重后的肺組織或消化后的細胞加入到細胞裂解液中充分勻漿后，于4℃裂解30 min，然后在4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，獲得澄清的組織勻漿或細胞裂解物。通過蛋白質定量(BCA)法測定蛋白質濃度。用SDS-PAGE凝膠對蛋白質(20 μg)進行分離后轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶將膜封閉2 h。然后，在4℃下用一抗孵育過夜：VE-Cadherin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)，α-SMA小鼠單克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)，Snail兔單克隆抗體(1∶1 000，CST公司)，β-actin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)。次日，回收一抗后將膜在TBST中充分洗滌，用抗兔IgG(1∶10 000，CST公司)和抗小鼠IgG(1∶10 000，CST公司)避光孵育1 h。回收二抗后用TBST充分洗滌，在Odyssey雙色紅外激光成像系統中顯影，對條帶灰度值進行統計分析。

1.6 免疫熒光檢測蛋白的表達 將肺組織石蠟切片放入60℃烘箱內烘烤20 min，二甲苯脫蠟后用檸檬酸鈉抗原修復液(pH 6.0)修復抗原。將切片放置于濕盒中,用5%山羊血清于37℃封閉1 h，去除封閉液，滴加VE- cadherin兔多克隆抗體(1∶100)和α-SMA小鼠單克隆抗體(1∶100)在4℃下孵育過夜。次日，將復溫的切片用PBS漂洗3次后，用抗兔IgG(1∶1 000，CST公司)和抗小鼠IgG(1∶1 000，CST公司)在37℃下避光孵育1 h。用Hoechst染細胞核3 min，滴加抗熒光淬滅劑封片。在光學顯微鏡(400倍)下觀察，并通過Fluoview程序拍照。

2 結 果

2.1 大鼠體質量、肺動脈壓力、右心室肥厚情況 MCT注射21 d后，對照組大鼠無死亡，模型組死亡3只，NaHS組死亡1只，PAG組死亡4只。結果(表1)顯示：與對照組相比，模型組大鼠體質量減小，mPAP、PASP升高，RVHI增加(P<0.05)，證明PAH模型構建成功。與模型組相比，NaHS組大鼠體質量增加，mPAP、PASP降低，RVHI減小(P<0.05)；PAG組體質量進一步減小，mPAP、PASP進一步升高、RVHI進一步增加(P<0.05)。

表1 各組PAH大鼠體質量、mPAP、PASP、RVHI比較

PAH：肺動脈高壓；NaHS：硫氫化鈉；PAG：炔丙基甘氨；mPAP：平均肺動脈壓；PASP：肺動脈收縮壓；RVHI：右心室肥厚指數.*P<0.05與對照組比較；#P<0.05與模型組比較

2.2 大鼠肺小血管形態學變化 大鼠肺組織H-E染色結果(圖1)顯示：對照組肺小動脈管壁較薄，血管結構清晰，內皮細胞分布均勻，外膜無明顯血管外基質沉積；模型組肺小動脈管壁增厚明顯(P<0.05)，管腔狹窄，血管中膜增生明顯，周圍組織炎性浸潤；NaHS組肺小動脈管壁增厚明顯減輕(P<0.05)，炎癥細胞浸潤減少；PAG組肺小動脈管腔接近閉塞(P<0.05)，血管壁失去正常結構。

圖1 硫化氫對MCT誘導的PAH大鼠肺組織的影響

2.3 大鼠EndMT情況 免疫印跡結果(圖2)顯示：與對照組相比，模型組Snail和α-SMA表達增加，VE-cadherin表達減少(P<0.05)。與模型組相比，NaHS組Snail和α-SMA表達減少，VE-cadherin表達增加(P<0.05)；PAG組Snail和α-SMA表達進一步增加，VE-cadherin表達進一步減少(P<0.05)。

免疫熒光結果(圖3)顯示：與對照組相比，模型組VE-cadherin表達減少，α-SMA表達增加。與模型組相比，NaHS組VE-cadherin表達增加，α-SMA表達減少；PAG組VE-cadherin表達進一步減少，α-SMA表達進一步增加。

圖2 免疫印跡檢測硫化氫對MCT誘導的PAH大鼠EndMT的影響

A：VE-cadherin和α-SMA；B：Snail；C：相對表達量比較.*P<0.05與對照組比較；#P<0.05與模型組比較

圖3 免疫熒光檢測硫化氫對MCT誘導的PAH大鼠肺小血管EndMT的影響

2.4 HPAECs形態學變化 對HPAECs予以TGF-β1刺激10 d后，于倒置顯微鏡100倍視野下觀察細胞形態，結果(圖4)顯示：對照組細胞排列規則，相互融合，細胞核呈卵圓形，以典型的“鵝卵石”樣生長；TGF-β1組細胞呈梭形生長，細胞間分界明顯，呈現出平滑肌樣細胞特征；NaHS預處理后，梭形細胞明顯減少(P<0.05)，細胞形態介于前2組之間。

2.5 HPAECs的EndMT情況 結果(圖5)顯示：TGF-β1誘導后，HPAECs中Snail、α-SMA表達增加，VE-cadherin表達減少(P<0.05)。NaSH預處理可劑量依賴性地逆轉這一變化，即Snail、α-SMA表達減少，VE-cadherin表達增加(P<0.05)。

圖4 硫化氫對TGF- β1誘導的HPAECs形態學變化

A：TGF- β1誘導10 d后形態學變化；B：TGF- β1誘導10 d后，梭形細胞比例比較.*P<0.05與對照組比較；#P<0.05與TGF- β1組比較

圖5 免疫印跡檢測硫化氫對TGF- β1誘導的HPAECs EndMT的影響

A：TGF- β1誘導3 d后VE-cadherin和α-SMA相對表達量；B：TGF- β1誘導1 d后Snail相對表達量；C：蛋白相對表達量統計學比較.*P<0.05與對照組比較；#P<0.05與模型組比較

3 討 論

內皮細胞發生EndMT的特征性變化主要表現為α-SMA增加、波形蛋白磷酸化及VE-cadherin的減少。EndMT已被證實存在于PAH患者，也可見于MCT誘導、MCT聯合缺氧和血管內皮生長因子受體阻滯誘導的PAH動物模型中。EndMT主要表現為內皮細胞遷移至內皮下間質，Twist-1表達增加，由p120連環蛋白和VE-cadherin介導的細胞黏附喪失[2-3, 6]。本研究進一步驗證了這些表型變化。

在心血管系統中，H2S主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)產生，能通過擴張血管維持心血管穩態，在抑制血管平滑肌細胞增殖和預防膠原重塑方面具有重要作用[15-16]。本課題組研究[17]已證明，給予NaHS (1 mg·kg-1·d-1)可以促進小鼠內皮細胞血管緊張素轉換酶2(ACE2)的表達和血管緊張素1-7(Ang 1-7)的產生，進而減輕小鼠動脈粥樣硬化。H2S的異常產生和功能障礙是幾種重要心血管疾病發展的關鍵因素，例如原發性高血壓、PAH、動脈粥樣硬化、血管鈣化和心臟肥大。

既往研究[18-20]已證實，H2S可以通過舒張平滑肌、抑制內皮素誘導的平滑肌細胞增殖或降低肺動脈內皮細胞炎癥水平來減輕大鼠PAH。但是，H2S是否通過調節EndMT來調控肺血管重構及PAH的進程，目前尚不清楚。本研究表明，外源性給予H2S供體(NaHS)顯著逆轉了EndMT過程，即NaHS部分改善了內皮細胞VE-cadherin的缺失和α-SMA的增加。由于手術時間不長，本研究在水合氯醛麻醉下[14]，短時間內經右心導管檢測肺動脈壓力，發現NaHS減輕了PAH程度；采用PAG抑制內源性H2S的合成后，則進一步促進了EndMT的發生，加劇了肺血管重構及PAH進程。本研究結果表明，H2S可能通過抑制EndMT，在MCT誘導的PAH中對肺組織發揮一定的保護作用。

TGF-β1是具有多種功能的細胞因子。有研究[21-22]表明，其參與血管內皮細胞EndMT過程。本研究應用TGF-β1刺激HPAECs 后3 d獲得明顯的EndMT，予以NaHS預處理后，內皮細胞的表型轉變被逆轉，與在MCT誘導的大鼠模型中的發現一致。

Snail是一個轉錄因子家族，通過抑制鈣黏蛋白的表達來促進EndMT[23]。因此，本研究還檢測了Snail表達水平的變化。動物模型的研究結果表明，模型組Snail表達增加，而NaHS干預后，Snail表達減少；與之相反，用PAG抑制內源性H2S后，則進一步刺激了Snail的表達。體外實驗結果與此結果一致。本研究結果進一步表明，H2S可通過抑制Snail的激活，影響PAH肺組織中EndMT現象。

此外，H2S還可能通過其他機制影響EndMT或上皮間質轉化(EMT)。有研究[24]表明，在腎小管上皮細胞中，H2S可通過抑制TGF-β1誘導的細胞外信號調節激酶(ERK)和Wnt/β-連環蛋白(β- catenin)通路的轉導，減輕TGF-β1誘導的EMT。Ying等發現，H2S可以通過Src途徑預防內質網應激誘導的EndMT[25]。此外，也有研究[26-28]發現，H2S可能通過Smad、Scr和p38途徑抑制EndMT。

綜上所述，本研究證實，H2S能減輕MCT誘導的大鼠PAH，此作用可能與其改善肺組織EndMT的作用有關。體外實驗進一步證實，H2S作為一種新型氣體信號分子，在EndMT中發揮重要的調控作用。H2S在PAH、纖維化、傷口修復、炎癥和惡性腫瘤中可能具有潛在的應用前景，值得進一步研究。