矮牽牛PhPYL4基因的克隆與表達分析

董 冬，王雪娣，劉同瑞，尹 偉，謝 宛，董麗麗

(1.淮南師范學院 生物工程學院/資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室，安徽淮南 232038；2.安徽農業大學 園藝學院，合肥 230036)

逆境脅迫對植物的生長發育會產生嚴重的影響，如干旱和鹽等非生物脅迫[1-2]。因此，培育抗逆性強的植物新品種對提高農業生產力、提升生產效率以及節約利用水和土地等自然資源均具有重要意義。脫落酸(Abscisic acid,ABA)作為一類重要的植物激素，不但參與植物的生長發育，如種子萌發和休眠、開花、氣孔關閉等，還能夠參與植物的多種逆境脅迫[3-4]。

PYRABACTIN RESISTANCE1(PYR1)/PYR1-LIKE(PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS(RCAR)是最先在擬南芥中鑒定的ABA受體，在ABA信號轉導中發揮著重要作用[5-6]。研究表明 PYR1/PYLs/RCAR家族共有14個成員，分別命名為PYR1和PYL1-13(RCAR1- RCAR14)。其中，PYL4被認為是泛素化蛋白[7]，能夠與RING FINGER OF SEED LONGEVITY1(RSL1)相互作用，且RSL1促進其體內降解[8]。而FYVE1/FREE1能夠與PYL4相互作用，介導其向液泡降解途徑的傳遞[9]。此外，轉基因試驗發現：擬南芥PYL4的過量表達能夠提高植物的抗旱性[10]，煙草NtPYL4在毛狀根中的過表達引起生物堿積累的下降[11]。上述研究結果表明PYL4參與植物的抗逆及次生代謝過程。然而，PYL4是否參與矮牽牛對植物的逆境脅迫響應，目前并不清楚。

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)是一種重要的園林觀賞植物和模式植物，培育抗逆性強的新品種是矮牽牛育種的重要方向。本研究從矮牽牛中分離PYL4的同源基因，并對該基因的生物學信息及其在不同組織及不同逆境處理下的表達特性進行分析。以期為豐富PYL4調控植物的抗逆機理奠定理論基礎，并為培育抗逆性強的矮牽牛新品種提供基因儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將供試材料矮牽牛W115系(Petunia×hybrida‘Mitchell’)實生苗種植于組培室中，培養條件：晝夜溫度為25 ℃/23 ℃，光照強度為300 μmol·m-2·s-2，光周期為16 h/8 h。

1.2 PhPYL4的克隆

根據公布的腋花矮牽牛(Petuniaaxillaris)基因組序列(https:∥solgenomics.net/)，分別設計全長引物PYL4-F:ATGCTTCCTAATTCTC AAAGCTCAT和PYL4-R:TCAAGTAGCCTTTCTTCTGCTCAAA。將矮牽牛葉片經液氮研磨后，使用TRIzol(Invitrogen，美國)試劑提取RNA，選取OD260/OD280>1.8且無降解的RNA，使用TransScript○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)反轉錄合成第一鏈cDNA。使用高保真酶KOD-Plus-Neo(TOYOBO，日本)進行擴增獲得PhPYL4序列。擴增條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，共35個循環。將克隆獲得的序列連接到pEASY-Blunt Simple載體(全式金)，鑒定陽性克隆送由通用生物系統(安徽)有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

使用DNAMAN 6.0軟件對蛋白相似性比進行分析。使用Protparam tool (http:∥web.Expasy.org/protparam/)對蛋白質的分子質量、等電點、分子式、氨基酸組成及疏水性等進行分析。使用Clustal X 2.0和MEGA 5.0等軟件進行蛋白遺傳聚類分析。

1.4 PhPYL4的表達分析

表達分析試驗均以30 d株齡的矮牽牛作為試材。分別取矮牽牛的根、嫩莖、葉片，提取RNA并反轉錄合成cDNA，用于PhPYL4的組織特異性表達分析；將矮牽牛幼苗根系于8:00置于含有200 mmol·L-1NaCl的霍格蘭氏營養液中[12]，分別于處理12 h和24 h后取葉片，提取RNA并反轉錄，用于鹽脅迫下PhPYL4表達水平的檢測；將矮牽牛幼苗根系于8:00置于含有體積分數為10% PEG-6000(Polyethylene Glycol 6000)的霍格蘭氏營養液中[12]，分別于12 h和24 h后取葉片，提取RNA進行反轉錄，用于干旱脅迫下PhPYL4基因的表達水平分析；于8:00對矮牽牛葉面噴施ABA(Abscisic acid，50 μmol·L-1)[13]，分別于12 h和24 h后取葉片，提取RNA并進行反轉錄，用于檢測ABA處理下基因的表達水平。以上所有試驗每個處理取10株苗，并設置3個生物學重復。

為獲得的PhPYL4的全長序列作為參考，利用Primer primer 5軟件設計熒光定量PCR引物：PYL4-RT-F:TAAACCACCTCAACAACTACAA，PYL4-RT-R:AACAAAAACACACG- TCTCATCC。取2 μg RNA，使用TransScript○ROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA模板。按照ChamQTMUniversal SYBR○RqPCR Master Mix(諾唯贊)的操作步驟，分別使用ABI 7500 Fast實時PCR系統和7500軟件(version 2.0.4)進行熒光定量PCR和數據分析。以矮牽牛ACTIN作為內參基因,采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量[14]。

2 結果與分析

2.1 PhPYL4基因全長序列的克隆及序列分析

根據已經公布的腋花矮牽牛基因組序列，設計引物擴增獲得PhPYL4的cDNA序列(圖1)。測序結果表明，PhPYL4基因序列全長為645 bp，共編碼214個氨基酸。推測PhPYL4蛋白的分子質量為23.60 ku，等電點為8.67，分子式為C1022H1662N306O316S10，不穩定系數為43.62，脂溶指數為89.11，親水性平均值(GRAVY)為 -0.239。該蛋白中相對含量較多的氨基酸依次為Val (11.7%)、Thr (9.3%)、Ser (8.4%)、Arg (7.0%)、Ile (6.5%)、Leu (6.5%)。總的帶負電荷的殘基(Asp+Glu)為18個，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys)為22個。

M.DL2000

2.2 PhPYL4蛋白的序列分析

將PhPYL4推測的蛋白序列與已公布的煙草、苜蓿、蓖麻、擬南芥等蛋白序列進行比對，序列相似性分別為91.63%、68.22%、62.44%和 57.08%(圖2)，推測PhPYL4是PYL4的同源蛋白。利用NCBI Conserved Domains軟件對PhPYL4序列進行分析，PhPYL4序列具有保守的疏水性配體結合結構域，隸屬于SRPBCC(START/RHOalphaC/PITP/Betv1/CoxG/CalC)超家族，推測可能具有該基因家族的生物學功能 (圖3)。

NaPYL4.煙草(XP_019243979)Nicotianatabacum(XP_019243979)；MtPYL4.苜蓿(XP_003623366.1)Medicagotruncatula(XP_003623366.1)；RcPYL4.蓖麻(XP_002526675.1)Ricinuscommunis(XP_002526675.1)；PYL4.擬南芥(NP_565887.1)Arabidopsisthaliana(NP_565887.1)

圖2 PhPYL4與其他物種PYL4的比對
Fig.2 Alignment of PhPYL4 with other PYL4

圖3 PhPYL4蛋白質結構域分析Fig.3 Structure domain analysis of PhPYL4

2.3 PhPYL4的系統發育分析

為研究PhPYL4與其他物種中PYL4的親緣關系，利用MEGA 5.0軟件，將矮牽牛PhPYL4與已公布的煙草、楊樹、向日葵、裂葉牽牛、棉花、黃瓜等15個物種的PYL4序列進行聚類分析，并構建系統發育進化樹。結果表明：PhPYL4與其他物種中的PYL4起源相同，但在進化的不同時期逐漸與其他物種分離開來。PhPYL4和煙草NtPYL4聚為一枝，親緣關系最近，而與胡楊PePYL4和橡膠HbPYL4親緣關系較遠(圖4)。

2.4 PhPYL4的組織特異性表達分析

為研究PhPYL4的表達特性，利用熒光定量PCR技術，對PhPYL4在矮牽牛不同組織中的表達水平進行檢測。如圖5所示：PhPYL4在矮牽牛的根、莖、葉中均有表達。PhPYL4的表達水平從高到低依次為：葉>莖>根。葉片中的表達量約為根中的14倍，而莖中的表達量約為根中的6倍。說明PhPYL4的表達具有明顯的組織特異性。

圖中的分支點數字表示基于500次重復該節點的自展支持率 The nodes in the figure show the bootstrap values based on 500 replications; 標尺代表遺傳距離 The scale represents the genetic distance；PePYL4.胡楊 (XP_011019068.1)Populuseuphratica(XP_011019068.1); HbPYL4.橡膠 (XP_021669328.1)Heveabrasiliensis(XP_021669328.1); CsPYL4.黃瓜 (XP_004148626.1)Cucumissativus(XP_004148626.1); GaPYL4.棉花 (XP_017603732.1)Gossypiumarboreum(XP_017603732.1); TcPYL4.可可 (XP_007026589.1)Theobromacacao(XP_007026589.1); OePYL4.橄欖 (XP_022882332.1)Oleaeuropaea(XP_022882332.1); SiPYL4.芝麻 (XP_011095066.1)Sesamumindicum(XP_011095066.1); HaPYL4.向日葵 (XP_021987876.1)Helianthusannuus(XP_021987876.1)；LsPYL4.萵苣(XP_023760467.1)Lactucasativa(XP_023760467.1)；CaPYL4.辣椒 (XP_016543230.1)Capsicumannuum(XP_016543230.1); InPYL4.裂葉牽牛 (XP_019161230.1)Ipomoeanil(XP_019161230.1); StPYL4.馬鈴薯(XP_006363617.1)Solanumtuberosum(XP_006363617.1);NtPYL4.煙草(XP_016465801.1)Nicotianatabacum(XP_016465801.1); DcPYL4.胡蘿卜 (XP_017253785.1)Daucuscarota(XP_017253785.1)；EsPYL4.山俞菜 (XP_006411045.1)Eutremasalsugineum(XP_006411045.1)

圖4 不同物種PYL4的系統進化分析
Fig.4 Phylogenetic analysis among different PYL4

圖5 矮牽牛不同組織 PhPYL4的相對表達量Fig.5 Relative expression of PhPYL4 in different tissues of Petunia

2.5 PhPYL4在不同脅迫下的表達分析

2.5.1 鹽脅迫 為研究鹽脅迫對PhPYL4的調控，對矮牽牛進行NaCl處理，分別于處理后 12 h和24 h對PhPYL4的表達水平進行檢測，以置于營養液中的矮牽牛作為對照。結果表明：鹽脅迫處理12 h后，PhPYL4的表達水平迅速上調為對照的6倍，而24 h后PhPYL4的表達水平逐漸下降為對照的4倍(圖6)。說明PhPYL4參與了矮牽牛鹽脅迫應答途徑。

圖6 PhPYL4在鹽脅迫下的表達分析Fig.6 Expression analysis of PhPYL4 under salt stress

2.5.2 干旱脅迫 研究表明PYL的多個家族成員經過表達后提高了干旱脅迫耐性，為揭示PhPYL4是否能夠響應干旱脅迫，分別在PEG模擬干旱處理12 h和24 h后檢測該基因的表達水平，以置于營養液中的矮牽牛作為對照。結果顯示：10% PEG-6000處理12 h后，PhPYL4的表達水平上升至對照的13倍。而處理24 h后，PhPYL4的表達水平為對照的10倍，相對于12 h時，表達水平有所下降(圖7)，說明干旱脅迫能夠顯著誘導PhPYL4的表達。

圖7 PhPYL4在模擬干旱脅迫下的表達分析Fig.7 Expression analysis of PhPYL4 under drought stress

2.5.3 ABA處理 為研究ABA對PhPYL4的調控作用，分別在葉面噴施50 μmol/L ABA，于12 h和24 h后檢測該基因的表達水平,并以未噴施ABA的矮牽牛作為對照。結果(圖8)顯示：ABA處理12 h后，PhPYL4的表達水平上調至對照的29倍。而處理24 h后，PhPYL4的表達水平為對照的11倍，相對于12 h時，表達水平顯著下降。說明PhPYL4能夠顯著響應ABA信號的誘導，且隨著處理時間的延長，響應減弱。

圖8 PhPYL4在ABA處理下的表達分析Fig.8 Expression analysis of PhPYL4 under ABA treatment

3 討 論

近年來，PYR/PYL/RCAR家族成員在毛果楊[15]、水稻[16]、短柄草[17]和棉花[18]等多個物種中得以鑒定，并被證明參與了干旱、鹽及寒冷等非生物脅迫響應。本研究中，克隆了矮牽牛PhPYL4的全長序列，通過對PhPYL4蛋白序列的生物信息學分析，發現PhPYL4具有一個保守的疏水性配體結合結構域。相關研究表明，該結構域是PP2C蛋白磷酸酶的結合位點，PP2Cs能夠與ABA受體相互作用從而抑制其活性[19]，并激活下游路徑。通過序列比對顯示，PhPYL4與蓖麻、苜蓿等物種同源序列的整體相似性為 70.84%，表明PYL4在不同物種間具有較高的保守性。PhPYL4的系統發育分析表明，PhPYL4與同科物種煙草NtPYL4親緣關系最近。綜合以上結果，可以證實所克隆的PhPYL4屬于PYR/PYL/RCAR蛋白家族成員，為PYL4的同源基因。

組織特異性表達分析顯示，PhPYL4在莖、葉片、根中均有表達，而在葉片中的表達量最高，顯著高于莖和根，這與杜梨PbPYL4在根、莖、葉中表達量差異較小的研究結果不同[20]，說明PYL4在不同物種中的表達特性存在差異。對矮牽牛進行鹽脅迫處理，結果顯示PhPYL4的表達水平在12 h時上調，24 h時開始下降，說明PhPYL4參與了矮牽牛對高鹽脅迫的響應過程。然而，對杜梨的研究發現：鹽脅迫12 h時，葉片與根中PbPYL4表達量均上調，鹽脅迫24 h時，根中PbPYL4表達量下降，而葉片中PbPYL4直到72 h時表達量開始下降[20]。此外，對擬南芥的研究發現，鹽脅迫引起PYL4表達量的下調[21]。綜合上述不同的研究結論，推測不同物種中PYL4的作用機制并不相同。PGE及外源ABA處理下，PhPYL4的表達水平同樣呈現先上升(12 h)后下降(24 h)的趨勢，說明PhPYL4能夠快速對干旱及ABA處理作出應答。但PhPYL4的變化趨勢與干旱及ABA處理引起擬南芥PYL4表達量下調的結果相反。然而，PYR1基因在鹽、模擬干旱脅迫及ABA處理下分別上調了6.73、 14.72、10.78倍[21]，這與矮牽牛PhPYL4對3種逆境條件下的響應趨勢相似。該研究結果說明PYR/PYL/RCAR家族成員在不同物種中的作用機制不同。

綜合上述研究結果，PhPYL4參與了矮牽牛響應干旱、鹽脅迫及ABA信號途徑,在調控矮牽牛的逆境響應機制中具有重要作用，但詳細的分子調控機制需進一步探索。該研究為后續揭示PhPYL4的功能奠定了理論基礎，同時為培育抗逆性強的矮牽牛新品種提供了候選基因。