產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌的篩選鑒定及產酶條件優化

柴金龍，王敏卜，杭加豪，張春光，陳 麗，焦豫良，李宜泳，房耀維，，劉 姝，

（1.江蘇海洋大學 海洋生命與水產學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222000；3.江蘇海洋大學 海洋資源與環境學院，江蘇 連云港 222005）

幾丁質（Chitin）又稱甲殼質、甲殼素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）以β-1,4糖苷鍵連接而成的天然高分子多糖，廣泛存在于無脊椎動物的外骨骼，其含量僅次于纖維素[1-2]。由于幾丁質中存在牢固的氫鍵使其性質相對穩定，不溶于水和大部分有機溶劑，難以應用。殼聚糖（chitosan）是幾丁質通過脫除乙酰基后的產物，具有更好的溶解性和生物相容性，在食品、醫藥、輕工、印染、環保和農業等領域具有很大的開發和應用潛力[3-4]。目前，殼聚糖的生產主要采用化學方法，此法易造成環境污染問題。酶法生產殼聚糖綠色環保，且反應條件溫和，能耗值相對較低，并可獲得脫乙酰程度均一穩定的產品。因此，運用幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）生產殼聚糖成為研究熱點[5]。

目前，真菌、細菌、昆蟲、病毒和原生動物都有產CDA的報道。其中報道最多的是卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）及菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum）等真菌CDA[6]。真菌CDA存在產酶活力低、難以催化晶體幾丁質和催化溫度較高的問題。細菌產CDA的報道較少，且報道的細菌多產幾丁質寡糖脫乙酰酶（chitin oligosaccharide deacetylases，COD），只能水解寡聚幾丁質脫乙酰基。海洋微生物豐富多樣，可分泌催化性質獨特的新穎酶類。本研究從海洋樣品中篩選產CDA細菌，對菌株進行鑒定和培養條件優化研究，提高發酵產酶水平，為殼聚糖的酶法制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

海泥樣品：采集于海州灣海域，置于含冰袋泡沫箱立即帶回實驗室進行菌株篩選。

1.1.2 試劑及培養基

幾丁質：江蘇澳新生物工程有限公司；其他生化試劑：上海博微生物科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速提取試劑盒：杭州寶賽生物科技有限公司；引物合成：南京思普金生物公司。

富集培養基：殼聚糖0.25%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，NaCl 0.01%，蒸餾水配制，pH 7.2～7.5。

產幾丁質脫乙酰酶篩選培養基：粉末幾丁質0.2%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%，對硝基-N-乙酰苯胺0.02%，瓊脂2.0%，陳海水配制，pH 7.0。

LB純化培養基：蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，酵母粉0.5%，瓊脂2.0%，陳海水配制，pH 7.0～8.0。

種子培養基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，陳海水配制，pH 7.0。

發酵培養基：蛋白胨1.0%，葡萄糖1.0%，MgSO40.05%，陳海水配制，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D單人單面超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；JXN-26 高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；Q5000微量紫外分光光度計：上海在途生物科技有限公司；Mastercycler nexus聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf有限公司；Nikon 90i全電動顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選

稱取1 g樣品于50 mL富集培養基，30 ℃、180 r/min培養3 d。取1 mL富集后的樣液梯度稀釋至10-6，選擇10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液0.2 mL涂布于產幾丁質脫乙酰酶篩選平板，30℃倒置培養2～7d，觀察菌落生長及變色圈產生情況。挑選產生黃色變色圈的菌株接種至LB培養基純化至單菌落后，斜面保藏。菌株接種至種子培養基培養24 h，再以1%（V/V）接種量接種至發酵培養基，30 ℃、180 r/min培養48 h。發酵液4 ℃、12 000×g離心10 min后測定幾丁質脫乙酰酶酶活。

1.3.2 菌株MCDA3-3的鑒定

選取變色圈最大的菌株，命名為MCDA3-3，根據伯杰氏細菌鑒定手冊對菌株MCDA3-3進行形態觀察和生理生化鑒定[7]。

1.3.3 菌株MCDA3-3的16S rDNA擴增及分析

用細菌DNA快速提取試劑盒提取MCDA3-3的基因組，進行16S rDNA擴增。PCR的通用引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1 492R：5'-GGTTACCTTGT TACGACTT-3'。反應體系為50 μL：Premix 25 μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃終延伸5 min。PCR擴增產物送至南京思普金公司測序，所得序列提交GenBank。將該序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，用MEGA 7.0軟件進行16S rDNA序列的比對分析，并構建系統發育樹。

1.3.4 培養基成分對菌株MCDA3-3發酵產酶的影響

發酵條件：以1%接種量將種子液接種到發酵培養基中，發酵培養基初始pH 7.0、裝液量為50 mL/250 mL，在30 ℃、180r/min條件下培養72h，進行幾丁質脫乙酰酶的酶活測定。

碳源的確定：分別添加1.0%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉。

氮源的確定：分別添加1.0%的蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米漿（干粉）、米糠、花生粕、麩皮、NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4。

無機鹽的確定：分別添加0.05%的MgSO4、CuSO4、CaCl2、NaH2PO4、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、BaCl2、FeCl3。

初始pH值的確定：改變培養基初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。

1.3.5 發酵條件對菌株MCDA3-3產酶的影響

基本條件：以1%接種量將種子液接種到發酵培養基中，發酵培養基初始pH 7.0、裝液量為50 mL/250 mL，在30 ℃、180 r/min條件下培養72 h，根據以下方法設置培養條件，并進行幾丁質脫乙酰酶的酶活測定。發酵溫度15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃；發酵時間24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h；接種量0.5%、1%、2%、3%、4%、5%；轉速100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min。

1.3.6 響應面法優化菌株MCDA3-3產酶條件

根據單因素結果，選擇對發酵產酶影響最顯著的木薯淀粉、FeCl3·6H2O及初始pH值3個因素為變量，酶活大小為響應值，運用Design Expert 11設計3因素3水平共17個試驗點的Box-Behnken響應面分析試驗。根據響應面分析的結果，配制最佳培養基做驗證試驗。

1.3.7 幾丁質脫乙酰酶酶活力的測定

試管中加入30 ℃預保溫的0.05 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液3mL，200mol/L的對硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，酶液1 mL，于30 ℃水浴反應15 min，沸水浴終止酶促反應，8 000×g離心10 min，測定上清液的吸光度值。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液作為對照。酶活單位（U）定義：在上述反應條件下每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。相對酶活（%）定義：以組內最高酶活為1，其他酶活與最高酶活的百分比即為相對酶活。

1.3.8 數據處理與分析

每組試驗設3組平行，重復試驗3次，試驗結果用平均值±標準方差（n=3）表示，采用Origin 2018作圖，響應面采用Design Expert 11進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 產幾丁質脫乙酰酶菌株的篩選

將富集培養的土樣涂布于產幾丁質脫乙酰酶的篩選培養基，挑取產黃色變色圈明顯的菌株共5株，變色圈最大的菌株為MCDA3-3。挑取單菌落至種子培養基，以1%接種量接種至發酵培養基30 ℃、180 r/min培養72 h后，4 ℃、12 000×g離心10 min，測定發酵上清中幾丁質脫乙酰酶的酶活為1.74 U/mL。

2.2 菌株MCDA3-3的鑒定

2.2.1 菌株MCDA3-3的形態學特征

菌株MCDA3-3的形態學觀察見圖1。由圖1可知，菌株MCDA3-3為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢。在LB培養基上25 ℃生長3 d，菌落呈圓形，灰褐色半透明，表面濕潤，邊緣規則，無暈環，中央突起，直徑0.1～0.5 mm，易挑取。

圖2 菌株MCDA3-3的形態觀察結果Fig.2 Morphological observation results of strain MCDA3-3

2.2.2 菌株MCDA3-3的生理生化特征

菌株MCDA3-3部分生理生化試驗結果見表1。結果表明，明膠液化試驗、H2O2試驗、反硝化、果糖試驗均呈陽性，吲哚試驗、三梨醇、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸鹽試驗均為陰性。

表1 菌株MCDA3-3的生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain MCDA3-3

2.2.3 菌株MCDA3-3的16S rDNA擴增及分析

將PCR產物送至南京思普金公司測序，所得1 335 bp序列提交GenBank（登錄號：MH988743）。將該序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，發現與菌株Nitratireductor aquimarinus（登錄號：HQ176466.1）16S rDNA相似性最高，達到100%。用MEGA 7.0軟件進行16S rDNA序列的比對分析，并構建系統發育樹，菌株MCDA3-3與Nitratireductor aquimarinus親緣關系最近（見圖2），因此將菌株MCDA3-3鑒定為海洋硝酸鹽還原菌（Nitratireductor aquimarinus）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株MCDA3-3的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain MCDA3-3 based on 16S rDNA sequence

2.3 培養基成分對菌株MCDA3-3產酶的影響

2.3.1 碳源對菌株MCDA3-3產酶的影響

碳源對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖3所示。碳源為木薯淀粉時相對酶活最高，最高酶活為2.85 U/mL，麥芽糖和葡萄糖的相對酶活也達到75%以上，而豌豆淀粉和玉米淀粉相對酶活較低，因此碳源確定為木薯淀粉。

圖3 碳源對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.3 Effect of carbon source on enzyme production by strain MCDA3-3

2.3.2 氮源對菌株MCDA3-3產酶的影響

氮源對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖4所示。氮源為豆粕和玉米漿時相對酶活都達到90%以上，其中豆粕最高，最高酶活為2.57 U/mL，而麩皮和米糠的相對酶活僅為30%左右，考慮到豆粕的成本高，因此氮源確定為玉米漿。

圖4 氮源對菌株MCDA3-3發酵產酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on enzyme production by strain MCDA3-3

2.3.3 無機鹽對菌株MCDA3-3產酶的影響

無機鹽對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖5所示，無機鹽為FeCl3時相對酶活最高，最高酶活為2.07 U/mL，其次是BaCl2、KH2PO4，而CuSO4、ZnSO4、CaCl2、MnSO4的相對酶活都低于30%，因此無機鹽確定為FeCl3·6H2O。

圖5 無機鹽對菌株MCDA3-3發酵產酶的影響Fig.5 Effect of inorganic salts on enzyme production by strain MCDA3-3

2.3.4 培養基初始pH值對菌株MCDA3-3產酶的影響

圖6 培養基初始pH值對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.6 Effect of initial pH of medium on enzyme production by strain MCDA3-3

培養基初始pH對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖6所示，隨著初始pH增大，相對酶活先上升后下降，pH較高時會使酶蛋白變性失活，pH 6.0相對酶活最高，最高酶活為2.74 U/mL，初始pH在5.0～9.0之間相對酶活都較高，達到60%以上，因此培養基初始pH確定為6.0。

2.4 發酵條件對菌株MCDA3-3產酶的影響

2.4.1 發酵時間對菌株MCDA3-3產酶的影響

發酵時間對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖7所示，隨著發酵時間延長，培養基中的營養物質逐漸被消耗，相對酶活先上升后下降，在48 h時相對酶活最高，最高酶活為2.35 U/mL，因此發酵時間確定為48 h。

圖7 發酵時間對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme production by strain MCDA3-3

2.4.2 發酵溫度對菌株MCDA3-3產酶的影響

發酵溫度對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖8所示，隨著發酵溫度的升高，相對酶活先上升后下降，溫度高時會使酶蛋白變性失活，30 ℃達到最大值，最高酶活為2.76 U/mL，溫度在15～40 ℃之間相對酶活都較高，達到60%以上，因此發酵溫度確定為30 ℃。

圖8 發酵溫度對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.8 Effects of fermentation temperature on enzyme production by strain MCDA3-3

2.4.3 接種量對菌株MCDA3-3產酶的影響

接種量對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖9所示，隨著接種量的增加，相對酶活先上升后下降，接種量高菌株生長迅速，營養物質消耗也隨之加快，接種量為4%時相對酶活最高，最高酶活為2.64 U/mL，因此接種量確定為4%。

圖9 接種量對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.9 Effect of inoculum on enzyme production by strain MCDA3-3

2.4.4 轉速對菌株MCDA3-3產酶的影響

轉速對菌株MCDA3-3產酶的影響如圖10所示，隨著轉速增加，相對酶活先上升后下降，轉速高菌株生長迅速，培養基營養物質消耗也加快，轉速為180 r/min時相對酶活最高，最高酶活為2.92 U/mL，因此轉速確定為180 r/min。

圖10 轉速對菌株MCDA3-3產酶的影響Fig.10 Effect of rotating speed on enzyme production by strain MCDA3-3

2.5 響應面法優化菌株MCDA3-3產CDA的發酵條件

在單因素試驗的基礎上，選擇碳源（木薯淀粉）、無機鹽（FeCl3·6H2O）、初始pH值3個因素為變量，以酶活大小為響應值，運用Design Expert 11設計3因素3水平共17個試驗點的Box-Behnken響應面分析試驗（表2）。對試驗數據進行回歸分析，得二次多項式方程：

由表3可知，從F值的大小可以得到，一次項中各因素對幾丁質脫乙酰酶酶活的影響順序是A＞C＞B。對幾丁質脫乙酰酶酶活的方差分析可得模型P＜0.01，表明該方程模型極顯著，不同處理間的差異性極顯著；失擬項P＞0.05，表明模型失擬項不顯著；模型的R2為0.965 4，說明該模型能解釋96.54%響應值的變化，因而該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以用于預測最優發酵條件參數。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據響應面三維圖結果（圖11）顯示，響應面開口朝下，響應值隨各自變量的值先增加后減少，說明此模型有突出穩定點，且穩定點是該模型的最大值。具體體現：初始pH值固定為6.0時，當FeCl3·6H2O添加量在0.043%～0.053%，木薯淀粉添加量在0.96%～1.11%區間內酶活顯示最大值；FeCl3·6H2O添加量為0.05%時，當木薯淀粉添加量在0.96%～1.12%之間，初始pH在5.56～6.11之間，酶活力顯示最大值；木薯淀粉添加量為1%時，當FeCl3·6H2O添加量在0.040 1%～0.053 5%之間，初始pH在5.55～6.10之間，酶活顯示最大值。

圖11 木薯淀粉、FeCl3·6H2O添加量與初始pH值交互作用對幾丁質脫乙酰酶酶活影響的響應曲面與等高線Fig.11 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between cassava starch,FeCl3·6H2O addition and initial pH on chitin deacetylase activity

利用響應面法對發酵工藝條件進行優化，得到最佳培養基組合為：木薯淀粉1.07%、FeCl3·6H2O 0.044 6%、初始pH值5.72，發酵產酶活預測值為4.23 U/mL。為了保證試驗的方便可行，將試驗條件修正為木薯淀粉添加量1.1%、FeCl3·6H2O添加量0.045%、初始pH 5.7進行驗證試驗，結果顯示，CDA酶活為4.07 U/mL，表明CDA的酶活與理論值非常接近，相對誤差＜5%，說明該方程擬合度很好，可以用來預測實際結果。

因此，菌株MCDA3-3產CDA的最佳培養基配方為木薯淀粉1.1%、玉米漿1.0%、FeCl3·6H2O 0.045%、陳海水配制，初始pH 5.7。最佳培養條件為：接種量4%、溫度30 ℃、180 r/min發酵48 h。通過優化，CDA酶活增加到4.07 U/mL，是優化前的2.3倍。

3 討論

目前，殼聚糖的生產主要采用化學方法。通過提高堿的濃度、反應溫度和延長反應時間可以提高殼聚糖的脫乙酰度。楊俊玲[8]用45%的NaOH溶液與甲殼素混合，在85 ℃水浴鍋中加熱3 h后水洗至中性，獲得的殼聚糖脫乙酰度為84.1%。NEMTSEV S V等[9]以蜂蜜為原料制備甲殼素，將甲殼素置于50%的NaOH溶液中水浴制得產率為16%～25%的殼聚糖。傳統的化學法提取殼聚糖存在很多的缺陷：使用了大量的酸堿，消耗能源的同時，環境污染嚴重[10]；殼聚糖的后續純化過程復雜，增加了生產成本；造成殼聚糖分子量及乙酰化程度的降低，從而影響殼聚糖產品品質。為了解決化學酸堿法帶來的問題，酶法生產殼聚糖作為一種新型綠色環保的脫乙酰方法，是利用專一性酶對幾丁質進行脫乙酰基處理，反應條件溫和，能耗值相對較低，可獲得脫乙酰程度均一穩定的產品[11]。

SURESH P V等[12]從泥土中分離出產CDA的青霉輪枝菌和尖孢鐮刀菌。HAMER S N等[13]研究了菜豆刺盤孢屬菌不同底物固態發酵生產CDA。王瑤等[14]從海邊紅樹林蝦場土壤中篩選的一株產CDA的放線菌桔橙小單孢菌（Micromonospora aurantiaca）。目前CDA產生菌以絲狀真菌居多，有被孢霉屬[15]、根霉屬[16]、帚霉屬[17]等。產CDA的細菌相對較少，有微小桿菌屬[18]和紅球菌屬[19-20]。

4 結論

從連云港市海州灣海域篩選獲得了一株產幾丁質脫乙酰酶細菌MCDA3-3，鑒定為海洋硝酸鹽還原菌（Nitratireductor aquimarinus）。優化獲得了該菌產CDA最適發酵培養基配方為木薯淀粉1.1%，玉米漿1.0%，FeCl3·6H2O 0.045%，陳海水配制，pH 5.7；最適發酵條件為接種量4%、30 ℃、180 r/min發酵48h。在此條件下培養，菌株酶活達到4.07U/mL，是優化前的2.3倍。